2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of fuctional molecular recognition elements utilizing a highly stable cushioning scaffold protein
| Project/Area Number |
19K05166
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
今中 洋行 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (10379711)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | バイオ分子 / 固定化 / 相互作用 / 蛋白質 / ペプチド / リガンド / 超好熱菌 / 足場 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
固体基材上においてバイオ分子間相互作用の高感度検出を可能とする簡便・迅速な測定システムの確立を目指し，研究を進めた．新規な足場タンパク質CutA1の利用に関し，分子設計多様性拡張の試みと機能検証を行った．令和２年度は，まずCutA1のモノマー配列をタンデムに繋いで一本鎖化したsingle-chained CutA1 (scCutA1)の分子認識素子としての利用の可能性について，CutA1サブユニット配列連結数が高次構造体の形成を通じた多価化構造体の取得と相互作用検出に及ぼす影響を調べた．その結果，scCut4～6 (連結数4～6)はいずれも可溶化発現し，SEC法により，三量体基本構造を基盤とした安定な高次構造体の混合物として存在していることがわかった．さらに，Enzyme-Linked Assay (ELA)によるSTII-StrepTactin (ST)間相互作用検出を行った結果，連結数の増加に応じ，感度の向上が見られた．
一方，scCutA1を足場とした高感度な生体分子間相互作用検出を可能とする機能性ナノバイオ界面の設計も行った．Bacillus amyloliquefaciens由来Barnase (Bn)とその阻害タンパク質であるBarstar (Bs)をタンパク質性分子糊としてscCutA1と組み合わせ，特性解析を進めた．scCutA1にBn及びBsを挿入したキメラタンパク質を調製後，Bn-Bs間相互作用による分子架橋を通じてナノバイオ界面へ凹凸を導入し，ELAによりSTII-ST間相互作用の検出を試みた．その結果，リガンド分子配置改変により，相互作用検出感度の向上がみられ，アナライト分子との相互作用の際に生じる立体障害緩和が有効であることが示された．
これらの検討を通じ，高次構造体形成を通じた新規分子認識素子の多価化の有効性に関する重要な知見を得た．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超好熱菌由来で極めて高い構造安定性を有するタンパク質であるCutA1を足場とした有用な分子認識素子の創出を試みた．まず，ホモ三量体であるCutA1サブユニットのタンデムな連結が高次構造体形成に及ぼす影響を調べ，連結数の増加に伴う発現産物の組成の違いを明らかにするとともに，生体分子間相互作用検出の向上に資する分子設計に対する重要な知見を得ることができた．また，タンパク質性分子糊（コネクタータンパク質）を利用した機能性ナノバイオ界面の設計について，利用可能性が見出されたBarnaseおよびBarstarのタンパク質ペアが一本鎖型CutA1分子内にそれぞれ挿入あるいは連結した状態で可溶化発現しうることを明らかにした．そして，CutA1を足場としたリガンド分子のナノメートルオーダーの配置制御によって生体分子間相互作用の検出感度の向上が可能であることを示した．これら当初予定していた研究について，特に遅れはなく，順調に進捗している.
|
| Strategy for Future Research Activity |
生体分子間相互作用の高感度検出を可能とする分子認識素子の創出を引き続き進めるとともに，基板表面上におけるリガンド分子配置の精密制御技術の開発を行う．まず，一本鎖型CutA1(scCutA1)の機能開発については，狙い通りの高次構造体を，混合物ではなく単一成分として取得するための設計指針を確立する．発現タンパク質のサブユニットが良好に折り畳まれ，安定なCutA1の三量体基本構造を担保しつつ特定のサブユニットと複合体を形成するよう，共発現あるいは同一タンパク質として発現させる．さらに，サブユニット間相互作用に関与する残基の改変やリンカー配列の分解を抑制するなどの対策を施しつつ各種分子を設計し，発現特性や量体構造，標的分子との相互作用検出特性などについて詳細に調査する．また，リガンド分子の配置制御に関しては，Barnase-Barstarペアとは異なるタンパク質性分子糊の適用も視野に入れ，scCutA1を足場としたリガンド分子複合体の取得を目指す．その際，リガンド分子を多価提示するだけでなく，基板表面との距離を精密に制御するためのスペーサータンパク質も同時に設計し，効率的に標的分子を捕捉しうる自在なナノバイオ界面の構築が可能か，詳細な検討を加える．他方，進化分子工学手法を用いた標的特異的分子認識素子の取得のため，ランダム配列が複数挿入された一本鎖型CutA1をT7ファージ上に提示するためのライブラリーデザインとその調製も進める．このように，各種分子の機能評価および利用のための技術開発を通じ，分子認識素子の配向制御，機能維持ならびに多価化を同時に担保しうる分子の設計・調製技術の基盤を確立する．
|
Research Products
(2 results)
