2020 Fiscal Year Research-status Report
Single-cell metabolomic and proteomic analyses in cancer cells by a novel mass spectrometry-based analytical system
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19K05167
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
和泉 自泰 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (70622166)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 1細胞メタボローム解析 / 1細胞プロテオーム解析 / シングルセル / 1細胞解析 / がん細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は，1細胞試料から代謝物を包括的に観測するために新規のメタボローム分析法の開発を行った．具体的には，1~3級アミンおよび4級アンモニウム基を修飾したメタクリレートポリマー粒子を設計し，親水性相互作用と陰イオン交換作用を連続的に組み合わせた親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィー高分解能タンデム質量分析法 (unified hydrophilic interaction/anion exchange liquid chromatography tandem mass spectrometry, unified HILIC/AEX/MS/MS) を開発した．本手法は，陽イオン性，両イオン性，陰イオン性の極性代謝物を一斉にクロマト分離，MS検出可能な唯一の手法であり，従来法よりも再現性，網羅性の点で優れていることを実験的に示した．さらに，開発した充填剤を基にnano-LCカラムを作製することで高感度かつ網羅的な1細胞メタボローム分析法の確立に成功した．
また，1細胞プロテオーム分析法についてもカラム内径のダウンサイジングとイオン化の際のバックグラウンドイオンを低減させることによって，従来システムよりもより高感度かつ網羅的なプロテオーム情報が取得できるようになった．
さらに，細胞周期の進行をリアルタイムに観察可能なFucci (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator) HeLa 細胞を使用して，細胞周期ごとの代謝物及びタンパク質の包括的かつ定量的な情報の取得を目指し予備検討を行った．予備検討の結果，細胞周期依存的な新規のタンパク質の同定に成功した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
昨年は1細胞メタボロームおよびプロテオーム分析法を達成するための要素技術を開発し， HeLa細胞から18種の親水性代謝物あるいは60種のタンパク質 (配列特異的なペプチド) を検出した．しかし，従来システムでは1細胞から取得可能な代謝物およびタンパク質の数はわずかであった．そこで，今年度は網羅性と検出感度を向上させるために1細胞分析システムの改良を行った．
1細胞メタボローム解析については，固定相の開発と各種分析条件の最適化を通して，HILICとAEXの分離モードが段階的に働く新しい液体クロマトグラフィーであるUnified HILIC/AEX分析法を考案した．その後，GL-HilicAex担体を充填した内径100μmのNano-LC分析カラムを用いてHeLa細胞の1細胞メタボローム解析を実施した．その結果1細胞からアミノ酸，核酸，補酵素を含む合計50種程度の代謝物の同定に成功し，従来法よりも網羅性が改善できた．1細胞プロテオーム分析についてはエレクトロスプレーイオン化 (ESI) 部分およびカラム内径のダウンサイジングを検討した．その結果，カラム内径を100μmから30μmにダウンサイジングし，Dream spray Nano-ESIを搭載することでHeLa1細胞から300種のタンパク質の同定・定量に成功した．
研究代表者は，1細胞チップにて各細胞を分離し，蛍光を指標に特性計測することで，異なる細胞タイプを定義・選定し，それらの細胞タイプの違いを代謝レベルで評価することを目指している．今年度は，細胞周期の進行をリアルタイムに観察可能なFucci HeLa 細胞を使用して，細胞周期ごとの代謝物及びタンパク質の包括的かつ定量的な情報の取得を行うための予備試験を行った．以上のことから，今年度は，当初の計画以上に研究が進展しているといえる．
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は最終年度であるため，これまで開発してきた全ての要素技術を組み合わせた1細胞メタボローム・プロテオーム分析法を用いて，細胞周期ごとの代謝物およびタンパク質の包括的かつ定量的な情報を収集する．本研究により，細胞周期と代謝制御に関する新たな知見の取得を目指すとともに，細胞周期が同じ細胞集団中の細胞の不均一性について調査する．
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| Causes of Carryover |
1細胞ピッキング装置の改良が予定していた金額よりも安く実施できたため73471円の繰越金が発生した．また次年度はNano-LC/MS装置を用いて多数の1細胞試料の測定を計画している．そのため，繰越金はNano-LC/MS分析を行うための消耗品費として使用する予定である．
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[Journal Article] Helicobacter metabolites exacerbate gastritis through C-type lectin receptors.2021
Author(s)
Nagata M, Toyonaga K, Ishikawa E, Haji S, Okahashi N, Takahashi M, Izumi Y, Imamura A, Takato K, Ishida H, Nagai S, Illarionov P, Stocker B L, Timmer M S M, Smith D G M, Williams S J, Bamba T, Miyamoto T, Arita M, Appelmelk B J, Yamasaki S*.
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Journal Title
J. Exp. Med.
Volume: 218(1)
Pages: e20200815
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Glioma cells require one-carbon metabolism to survive glutamine starvation.2021
Author(s)
Tanaka K*, Sasayama T, Nagashima H, Irino Y, Takahashi M, Izumi Y, Uno T, Satoh N, Kitta A, Kyotani K, Fujita Y, Hashiguchi M, Nakai T, Kohta M, Uozumi Y, Shinohara M, Hosoda K, Bamba T, Kohmura E.
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Journal Title
Acta Neuropathol. Commun.
Volume: 9
Pages: 16
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Ddhd1 knockout mouse as a model of locomotive and physiological abnormality in familial spastic paraplegia.2021
Author(s)
Morikawa T, Ohishi H, Kosaka K, Shimojo T, Nagano A, Taniguchi I, Fujioka R, Moriyama K, Unoki M, Takahashi M, Nakao M, Izumi Y, Bamba T, Sasaki H, Miura S, Shibata H*.
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Journal Title
Biosci. Rep.
Volume: 41(2)
Pages: BSR20204171
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Calibration-curve-locking database for semi-quantitative metabolomics by gas chromatography/mass spectrometry.2021
Author(s)
Hata K#, Soma Y#, Yamashita T, Takahashi M, Sugitate K, Serino T, Miyagawa H, Suzuki K, Yamada K, Kawamukai T, Shiota T, Izumi Y*, Bamba T*.
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Journal Title
Metabolites
Volume: 11(4)
Pages: 207
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Eicosapentaenoic acid attenuates renal lipotoxicity by restoring autophagic flux.2020
Author(s)
Yamamoto T, Takabatake Y*, Minami S, Takahashi A, Sakai S, Fujimura R, Takahashi A, Namba-Hamano T, Matsuda J, Kimura T, Matsui I, Kaimori J, Takeda H, Takahashi M, Izumi Y, Bamba T, Matsusaka T, Niimura F, Yanagita M, Isaka Y.
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Journal Title
Autophagy
Volume: 28
Pages: 1-14
DOI
Peer Reviewed
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