2019 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質発現を促進させるLEAペプチドの機能発現に至る原理の究明
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19K05168
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
池野 慎也 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 准教授 (20437792)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | LEAペプチド / 大腸菌 / 組換えタンパク質 / 分子シールド機能 / シャペロン様活性 / 分子間相互作用 / 分子クラウディング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
LEAタンパク質は乾燥ストレスを受けたときに発現し、細胞内のタンパク質凝集を抑制する機能を有する。このLEAタンパク質の配列をベースにLEAペプチドを設計し、それを大腸菌内で目的タンパク質と共発現させると目的タンパク質の発現量が倍増することを発見し報告してきた。これまでの研究結果から、LEAペプチドの機能について、①未成熟ポリペプチドの凝集を抑制しフォールディングを促進するシャペロン様活性説、②発現したタンパク質を分解などから保護する分子シールド機能説の仮説を立てている。
細胞内には様々な生体分子が複雑に入り込んでいるため、LEAペプチドの動態を細胞内で直接に捉えることが非常に難しい。そこで本研究では、タンパク質合成に必須の成分のみで構成された無細胞タンパク質発現系および合成ペプチドを利用し、試験管内での現象・相互作用を解明することによりLEAペプチドの機能の解明を目的としている。
本年度は、人工合成したLEAペプチドを用いて分子シールド機能の解明をおこなった。検証の結果、LEAペプチドは熱や塩によるタンパク質の凝集を抑止する機能は確認されなかった。分子シミュレーションによる相互作用の予測では、GFPのβバレルと離れた親水的なGFP表面と相互作用していることが確認された。しかし、等温滴定型熱量測定によりLEAペプチドはGFPと相互作用していないことが示唆され、熱示差走査蛍光強度測定によりLEAペプチドがタンパク質の構造安定性を向上しないことが示唆された。また、CDスペクトル測定ではLEAペプチドが極端な疎水的環境でないとαヘリックス構造をとらないことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本仮説検証として否定的な結果が多かったが、LEAペプチドの機能を解明するためには、細胞内のように混み合った状態に分子が存在する分子クラウディングの概念を応用して検証する必要性があることが判明したことは大きい。そのため全体でみるとおおむね順調であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
生体内では分子シールド機能を果たしている可能性も残されており、分子クラウディングの概念のもと、細胞内に近い環境下での評価を行っていく。また、再構成型の無細胞タンパク質合成系を利用して、シャペロン様活性としてのLEAペプチドの評価も行っていく。
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| Causes of Carryover |
オープンアクセスジャーナルへの投稿を見込んで、その費用を計画に入れていたが、本年度はその支弁がなかったため、論文投稿に関わる費用として次年度に使用する。
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