2020 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質発現を促進させるLEAペプチドの機能発現に至る原理の究明
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19K05168
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
池野 慎也 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 准教授 (20437792)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | LEAタンパク質 / LEAペプチド / 大腸菌 / 組換えタンパク質発現 / シャペロン様活性 / GFP / 無細胞タンパク質合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
LEAタンパク質には、乾燥や塩ストレスなどに伴うタンパク質の凝集を抑制する作用を持つことが知られている。申請者は、このLEAタンパク質の配列をベースにLEAペプチドを設計し、それを大腸菌内で目的タンパク質と共発現させると目的タンパク質の発現量が倍増することを発見し報告してきた。これまでの知見からLEAペプチドの細胞内での機能について、LEAペプチドが「分子シールド機能」を有することでタンパク質同士の凝集を抑制する仮説、LEAペプチドが「分子シャペロン機能」を持ちタンパク質のフォールディングを促進することで発現量を増大させている仮説を立てている。細胞内には様々な生体分子が複雑に入り込んでいるため、LEAペプチドの動態を細胞内で直接捉えることが非常に難しい。そこで本研究では、タンパク質合成に必須の成分のみで構成された無細胞タンパク質発現系および合成ペプチドを利用し、試験管内での現象・相互作用を解明することによりLEAペプチドの機能の解明を行っている。
初年度の研究では、人工合成したLEAペプチドを用いて分子シールド機能の解明をおこなったが、細胞内においてLEAペプチドは分子シールド機能を有していない可能性が示唆された。そこで本年度は、再構成型の無細胞タンパク質合成系を利用して、LEAペプチドによる目的タンパク質の発現量増大を検討した。目的タンパク質としてGFPを単独で発現させた場合と比較して、GFPとLEAペプチドを共発現させるとGFP発現量が2.5倍ほど増加した。また、GFPを単独で発現するサンプルに合成LEAペプチドを添加させた場合、分子クラウディング条件下においてLEAペプチドの添加量の増加に伴いGFP発現量が有意に増大した。これらの結果から、LEAペプチドはフォールディングを促進する分子シャペロンとして機能している可能性が高いと考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本仮説検証として、LEAペプチドがフォールディングを促進する分子シャペロン様分子として機能している可能性が高いことが分かり、メカニズム解明に向けて前進した。特に細胞内のように混み合った状態に分子が存在する分子クラウディング条件下で有意に機能を発揮していることを確認できたことは非常に大きい。
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| Strategy for Future Research Activity |
分子クラウディング条件下におけるタンパク質のリフォールディング実験により、本ペプチドによるシャペロン様活性説の解明を進めていく。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍による出張がなくなったことにより旅費の計上がゼロであったことと、オープンアクセスジャーナルへの投稿を見込んでその費用を計画に入れていたが、本年度はその支弁がなかったため次年度使用額が生じた。論文投稿に関わる費用として次年度に使用する。
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