2019 Fiscal Year Research-status Report
人工的な複合微生物反応場の構築と難培養性微生物の取得
| Project/Area Number |
19K05170
|
|---|
| Research Institution | Osaka City University |
|---|
Principal Investigator |
尾島 由紘 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 准教授 (20546957)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | フロック / 大腸菌 / グリセロール / エチレングリコール / 外膜小胞 / 難培養性微生物 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
1. フロック形成機構ならびにポリオールによる形成促進機構の解明
大腸菌は通常フロックと呼ばれる浮遊性の凝集塊を形成しないが、先行研究よりペリプラズムプロテアーゼをコードするdegP遺伝子を欠損させると、数mm程度のフロック形成が確認された。ただ形成量は少なく、形成機構について未解明な点が多かった。本研究では、培地中のグリセロール濃度依存的にΔdegPフロック形成量が増加することを発見し、グリセロールがフロック形成に与える影響について検討を進めた。結果として、10%(v/v)のグリセロール添加で最もフロック形成量が増加したが、グリセロールは培養中に基質として消費されておらず、その影響で増加した培地の粘度や忌避応答も形成促進とは無関係であった。一方、同じくポリオールの一種であるエチレングリコールを添加すると、グリセロールと同じ濃度依存的なフロック形成量の促進が確認された。共通の現象として、フロック内の生細胞の低下、外膜小胞の増加に代表される細胞膜ストレスの増加が確認され、低分子ポリオールによる膜ストレスを介したフロック形成の促進を結論づけた。
2. 大腸菌フロックの複合微生物化と難培養性微生物の取得
先行研究において、大腸菌の凝集塊である大腸菌フロックを難培養性微生物の増殖の足場として応用することを見据え、モデル微生物として酵母を用い、フロック内での培養に成功している。本研究ではまず、フロック内での酵母の増殖に適した培地の検討を行い、培養後に血球計算盤およびqPCR法により酵母数を定量したところ、8倍希釈した酵母培養用YPD培地が酵母の大腸菌フロック内での増殖に最も適していた。さらに難培養性微生物のフロック内での培養に向けて、微生物の休眠状態を打破する蘇生因子を放出することで知られているMicrococcus luteusをヘルパー細胞としてフロックに付着させることに成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グリセロールが大腸菌degP遺伝子欠損株のフロック形成を促進する理由については、短鎖ポリオール特異的な効果であることと、フロック内の生菌数の低下や外膜小胞の産生増加などに基づき、細胞膜の損傷が関わっていることまで明らかにすることができており、今後のフロック形成現象の複合微生物化に向けて重要な知見を得た。難培養性微生物の取得に関しては、準備段階として蘇生因子を放出するヘルパー微生物を大腸菌フロックに付着させることができたため，今後は環境中の微生物サンプルとの共培養を行い、難培養性微生物の可培養化を実証していきたい．
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. フロック形成機構ならびにポリオールによる形成促進機構の解明
大腸菌フロック形成機構ならびに短鎖ポリオールがdegP遺伝子欠損株のフロック形成促進する理由については、フロック内の生菌数の低下や外膜小胞の産生増加などに基づき、細胞膜の損傷が関わっていることまで突き止めており、その全体像を明らかにすることができた。今後は、短鎖ポリオールがフロック形成大腸菌の細胞膜に与える影響の詳細について、電子顕微鏡観察などを用いながら明らかにしてきたい。
2. 大腸菌フロックの複合微生物化と難培養性微生物の取得
これまで、大腸菌フロック上でのモデル微生物の生菌数の定量評価方法の構築と、蘇生因子を放出するヘルパー微生物の定着化に成功した。今後は、この人工的に調製された複合微生物フロックを用いて，活性汚泥を初めとした環境サンプルとの共培養を行い，難培養性微生物の共生による取得を試みる．評価は，変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)と，場合によっては所属機関で利用可能な次世代シーケンサーを用いて，フロック中での難培養性微生物の共生の有無と産業的有用性を判断する．さらに共生に必須な因子を明らかにすることで純粋培養を試みる．純粋培養が困難である場合は，共生フロックそのものを沈降性に優れた生体触媒として，含まれる難培養性微生物のゲノム配列から期待される有用物質生産反応や，有害物分解反応への応用に関して検証する．
|
| Causes of Carryover |
年度末の実験実施量が研究計画を下回ったため、物品費が使用計画よりも少し低く抑えられ次年度使用額が発生した。こちらは次年度の物品費として合わせて使用する予定である。
|
