2019 Fiscal Year Research-status Report
Lignin degrading activities of herbivorous land crabs
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19K05173
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
三宅 克英 名城大学, 理工学部, 教授 (90252254)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | リグニン / 2,6-ジメトキシフェノール / アカテガニ / ラッカーゼ / グアヤコール / ABTS / 中腸腺 / RNA-seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アカテガニRNA-seqのデータ解析から、リグニン分解に関係する可能性の高いラッカーゼ遺伝子産物 (#24131)を見出し、アカテガニ中腸腺cDNAからPCRで増幅し、大腸菌発現ベクターにクローン化した。アカテガニ中腸腺ではラッカーゼ遺伝子産物は11種類が検出されたが、当該ラッカーゼが全発現量の90%以上を占めており、大きな役割を担っているものと期待している。大腸菌では精製するためにHis-tag融合蛋白質として本ラッカーゼを生産し、精製することができた。このラッカーゼの活性を検出するために、グアヤコール、2,6-ジメトキシフェノール(2,6-DMP)、ABTSというリグニン類縁化合物と反応させてみたところ、2,6-DMPとABTSに対して高い反応性を示した。グアヤコールに対しては反応しない。これまでの研究で高いグアヤコール反応活性をアカテガニのメスから検出したという報告をおこなっているが、今回単離したラッカーゼはこの活性には関与していないことがわかった。しかし、多い発現量、高い反応性という点から考えると、本酵素もリグニン分解に対して大きな役割を果たしていることが期待される。この酵素遺伝子のC末側には銅結合部位が２箇所存在しており、銅の必要性が推定された。実際、反応には銅が必須ということがわかった。上記のグアヤコール酸化活性には銅は不要であり、酵素の特性に大きな違いが見られる。また、この酵素遺伝子の活性から、アカテガニもこの活性を示すのではないかと考え、中腸腺での2,6-DMP, ABTS酸化活性を調べてみると、大きな反応性を示すことがわかった。以前検証したときにはほとんど活性を検出できなかったが、これは銅を反応に加えていなかったからだと思われる。いずれにせよアカテガニ中腸腺にはリグニン分解活性を示す酵素が最低２種類は存在していることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アカテガニからリグニン分解に応用できる可能性の高いラッカーゼ遺伝子を単離し，活性を検出することに成功している。この酵素は、実際のリグニンにも反応性を示しており、大いに期待できる。また他の遺伝子として、グアヤコール酸化活性を担う可能性のある遺伝子グルタチオンパーオキシダーゼの検出もできている。
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| Strategy for Future Research Activity |
単離したアカテガニラッカーゼの機能解析を更に進める。グルタチオンパーオキシダーゼについては、全長ｃDNA配列を明らかにして（c末が欠損）、アカテガニcDNAからPCRで増幅し、大腸菌発現ベクターにクローン化する。精製してグアヤコール酸化活性を示すかどうか検討する。両酵素を併用して，リグニンにどのくらいの反応性を示すか検証する。リグニンとしては市販のものを使うが、植物バイオマスである木や葉、木材チップに対してセルラーゼを作用させるときに、役に立つかどうかも検討する。ラッカーゼやオキシダーゼがあれば、セルラーゼの作用が増し、バイオマスから糖分が溶出してくる可能性がある。天然リグニンが入手可能であれば、これも検証する。また、アカテガニよりも草食性が強い近縁種、クロベンケイガニについてもRNA-seqを行い、発現遺伝子を解析する。アカテガニよりも強いリグニン分解酵素活性を示す酵素が見つかる可能性は非常に高い。これらの酵素群を活用して、植物バイオマスの効率的利用に結びつく技術の開発をめざす。
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| Causes of Carryover |
年度末に残額よりも大きな金額の試薬を注文してしまい、この試薬に関しては次年度の費用で支払うこととした。
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