2019 Fiscal Year Research-status Report
昆虫抽出液を用いた高効率完全無細胞タンパク質合成系の構築
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19K05176
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| Research Institution | Okinawa National College of Technology |
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Principal Investigator |
伊東 昌章 沖縄工業高等専門学校, 生物資源工学科, 教授 (00395659)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 無細胞タンパク質合成系 / カイコ / 翻訳促進配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、合成効率および利便性の向上を図ることで昆虫無細胞タンパク質合成系を「創薬研究・ポストゲノム研究に使われる技術」にすることを目的とした。具体的には、以下の研究を進める。１． RNA二次構造予測と翻訳促進配列のスクリーニング・変異解析を通して、新たな翻訳促進配列を創造し、反応条件等を最適化することで、現状の8倍以上の合成量とする。２．創造した翻訳促進配列、最適な反応条件等をもとに、PCRのみで鋳型DNAを調製する プライマーを設計・利用し、鋳型DNA調製からタンパク質合成まですべての実験工程が遺伝子組換え実験に該当しない系を構築する。上記を達成し、「昆虫抽出液を用いた高効率完全無細胞タンパク質合成系を構築」する。
今年度は、上記のうち、翻訳促進配列の最適化や実験系の効率化検討を行った。まず、mRNA精製の手間を省いて簡便に無細胞タンパク質合成を行うために、Link法の最適キレート剤濃度を検討した。その結果、EDTA 0.75 mMにおいて最も合成量が高いことが明らかとなった。翻訳促進配列の検討では、MnNPVポリヘドリン遺伝子5'-UTR由来翻訳促進配列およびIGR-IRES翻訳促進配列の翻訳促進能を比較した。その結果、MnNPV翻訳促進配列がよりカイコ無細胞系に適した翻訳促進配列であることがわかった。実験系の効率化を図るために、まず、MnNPV翻訳促進配列のコア配列を元にプライマーを設計し、PCRによる鋳型DNAの作製を行った．設計したプライマーによって得られたDNAを鋳型としたmRNAから目的タンパク質が合成され、従来行っていた大腸菌遺伝子組換え法による鋳型DNA作製操作を省くことに成功した。
以上の結果より、翻訳促進配列を検討し、カイコ無細胞タンパク質合成系における実験操作の効率化に成功し、完全無細胞タンパク質合成系の構築に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、カイコ無細胞系を創薬・ポストゲノム研究の現場で使用可能な系とすることを目的として、翻訳促進配列の最適化や実験系の効率化検討を行った。
まず、mRNA精製の手間を省いて簡便に無細胞タンパク質合成を行うために、Link法の最適キレート剤濃度を決定することができた。また、MnNPVポリヘドリン遺伝子5'-UTR由来の翻訳促進配列がよりカイコ無細胞系に適した翻訳促進配列であることがわかった。さらに、設計したプライマーによって得られたDNAを鋳型としたmRNAから目的タンパク質が合成され、従来行っていた大腸菌遺伝子組換え法による鋳型DNA作製操作を省くことに成功した。
以上のことから、今年度の研究を進めたことにより、完全無細胞タンパク質合成系の構築に成功することができた。このことから研究はおおむね順調に進呈している。
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| Strategy for Future Research Activity |
二年目となる次年度は、今年度構築することができた従来行っていた大腸菌遺伝子組換え法による鋳型DNA作製操作を省くことが可能となった完全無細胞タンパク質合成系のブラッシュアップを図っていく。具体的には、以下の項目を実施していく。
１．5'-UTRおよび3'-UTRの最適化 今年度は、5'-UTRとしてMnNPV翻訳促進配列のコア配列、3'-UTRとしては、カイコフィブロイン遺伝子由来の3'-UTRを用いたが、さらにスクリーニングを行い、最適な5'-UTRおよび3'-UTRを見出し、合成量向上につなげる。
２．使用するプライマーの短縮化 現在構築した完全無細胞タンパク質合成系には、それぞれ71, 69merの長さのプライマーを用いている。これを各40mer程度の4-6種類のプライマーを用いることでプライマーを短縮化し、コスト、プライマー合成期間の削減を図ることで実用的かつ多検体処理が可能な系に仕上げる。
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