2020 Fiscal Year Research-status Report
昆虫抽出液を用いた高効率完全無細胞タンパク質合成系の構築
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19K05176
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| Research Institution | Okinawa National College of Technology |
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Principal Investigator |
伊東 昌章 沖縄工業高等専門学校, 生物資源工学科, 教授 (00395659)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 無細胞タンパク質合成系 / カイコ / 翻訳促進配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、合成効率および利便性の向上を図ることで昆虫無細胞タンパク質合成系を「創薬研究・ポストゲノム研究に使われる技術」にすることを最終目的とした。具体的には、以下の研究を進める。１． RNA二次構造予測と翻訳促進配列のスクリーニング・変異解析を通して、新たな翻訳促進配列を創造し、反応条件等を最適化することで、現状の8倍以上の合成量とする。２．創造した翻訳促進配列、最適な反応条件等をもとに、PCRのみで鋳型DNAを調製する プライマーを設計・利用し、鋳型DNA調製からタンパク質合成まですべての実験工程が遺伝子組換え実験に該当しない系を構築する。上記を達成し、「昆虫抽出液を用いた高効率完全無細胞タンパク質合成系を構築」することを目的としている。その中で、昨年度は、翻訳促進配列を検討し、カイコ無細胞タンパク質合成系における実験操作の効率化に成功し、完全無細胞タンパク質合成系を構築することができた。
そこで、今年度は、まず、合成量向上に向けて、カイコ幼虫後部絹糸腺由来抽出液調製条件の検討を行った。その結果、一般品種の５齢５日のカイコの後部絹糸腺を摘出し、ダウンスホモジナイザーを用いて破砕・抽出方法の検討を行い、また、抽出用緩衝液量を最適化することで、β-ガラクトシダーゼの合成を指標とした場合で、100μg/ml以上の合成能を有する抽出液の調製方法を確立した。また、その抽出液を用いたRNA精製の手間を省くLink法の最適キレート剤濃度を検討した。その結果、EDTA 0.5 mMにおいて最も合成量が高いことが明らかとなった(昨年度の条件である0.75mMから変更）。以上を行うことで、カイコ無細胞タンパク質合成系における合成量の向上に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は、翻訳促進配列の最適化や実験系の効率化検討を行い、また、設計したプライマーによって得られたDNAを鋳型としたmRNAから目的タンパク質が合成され、従来行っていた大腸菌遺伝子組換え法による鋳型DNA作製操作を省くことに成功し、完全無細胞タンパク質合成系を構築することができた。
今年度は、まず、合成量向上に向けて、カイコ幼虫後部絹糸腺由来抽出液調製条件の検討を行った。また、その抽出液を用いたRNA精製の手間を省くLink法の最適キレート剤濃度を検討した。それぞれを最適化することにより、β-ガラクトシダーゼの合成を指標とした場合で、100μg/ml以上の合成量を達成することができた。以上を行うことで、カイコ無細胞タンパク質合成系における合成量の向上に成功した。
これらのことから、完全無細胞タンパク質合成系を構築することができ、合成量向上も達成できたことから研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は３年間の最終年度となるため、当初の目標である合成効率および利便性の向上を図ることで昆虫無細胞タンパク質合成系を「創薬研究・ポストゲノム研究に使われる技術」にすることを目指して、これまでの成果をもとにさらに検討が必要な項目を選択し研究を推進する。具体的には、一昨年度で達成した完全無細胞タンパク質合成系の技術と、昨年度取り組み合成量向上に成功した技術を組み合わせ、さらに、新たな翻訳促進配列を創造し、反応条件等を最適化することで、現状の8倍以上の合成量とする。また、創造した翻訳促進配列、最適な反応条件等をもとに、PCRのみで鋳型DNAを調製する プライマーを設計・利用し、鋳型DNA調製からタンパク質合成まですべての実験工程が遺伝子組換え実験に該当しない系を構築する。上記を達成し、さらに使いやすい昆虫抽出液を用いた高効率完全無細胞タンパク質合成系を構築する。
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