2021 Fiscal Year Annual Research Report
昆虫抽出液を用いた高効率完全無細胞タンパク質合成系の構築
| Project/Area Number |
19K05176
|
|---|
| Research Institution | Okinawa National College of Technology |
|---|
Principal Investigator |
伊東 昌章 沖縄工業高等専門学校, 生物資源工学科, 教授 (00395659)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 無細胞タンパク質合成系 / カイコ / 翻訳促進配列 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、合成効率および利便性の向上を図ることで昆虫無細胞タンパク質合成系を「創薬研究・ポストゲノム研究に使われる技術」にすることを最終目的とした。具体的には、以下の研究を進めた。１． RNA二次構造予測と翻訳促進配列のスクリーニング・変異解析を通して、新たな翻訳促進配列を創造し、反応条件等を最適化することで、現状の8倍以上の合成量とする。２．創造した翻訳促進配列、最適な反応条件等をもとに、PCRのみで鋳型DNAを調製する プライマーを設計・利用し、鋳型DNA調製からタンパク質合成まですべての実験工程が遺伝子組換え実験に該当しない系を構築する。上記を達成し、「昆虫抽出液を用いた
高効率完全無細胞タンパク質合成系を構築」することを目的とした。
まず、翻訳促進配列を検討し、カイコ無細胞タンパク質合成系における実験操作の効率化に成功し、完全無細胞タンパク質合成系を構築することができた。次に、合成量向上に向けて、カイコ幼虫後部絹糸腺由来抽出液調製条件の検討を行った。その結果、一般品種の５齢５日のカイコの後部絹糸腺を摘出し、ダウンスホモジナイザーを用いて破砕・抽出方法の検討を行い、また、抽出用緩衝液量を最適化することで、β-ガラクトシダーゼの合成を指標
とした場合で、100μg/ml以上の合成能を有する抽出液の調製方法を確立した。また、その抽出液を用いたRNA精製の手間を省くLink法の最適キレート剤濃度を検討した。その結果、EDTA 0.5 mMにおいて最も合成量が高いことが明らかとなった。これらにより、カイコ無細胞タンパク質合成系における合成量の向上に成功した。
以上のことから、本研究を遂行することにより、完全無細胞タンパク質合成系を構築することができ、合成量向上もできたことから当初の目標を達成することができた。
|
