2021 Fiscal Year Research-status Report
プラズモン共鳴による光濃縮効果を用いた膜タンパクの結晶化
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19K05291
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
奥津 哲夫 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (20261860)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀内 宏明 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (00334136)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 結晶成長 / プラズモン共鳴 / 膜タンパク質 / 脂質立方相 / 金ナノ粒子 / 増強電場 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バクテリオロドプシンの結晶化を、金ナノ構造上で光誘起結晶化により行った。バクテリオロドプシンは研究室で発現した。金ナノ構造はガラス基板に金スパッタリングを5nmの厚みで施し、吸収スペクトルが600-900nmに出現するように製作した。この波長に吸収を持つことは、金ナノ構造がナノメートルスケールでギャップ構造を有していることを意味する。この基板に脂質立方相に分散させたバクテリオロドプシンを滴下した。脂質立方相としてモノオレインを用いた。バクテリオロドプシンの濃度を19mg/mLとし、電解質としてpH5.5 3M Na/K Pi緩衝溶液を用い、塩濃度を3.0, 2,7, 2,4, 2.0Mとして実験を行った。塩濃度は結晶が自発的に出現する濃度から、出現しない濃度まで振ってある。実験は結晶が出現しなかった試料に光を当てると結晶が出現したという結果を得るように構成してある。光照射はLED光源のマグライトを用いた。
塩濃度が3.0Mの試料で多くの細かい結晶が出現した。2.0Mの試料では結晶は出現しなかった。2.4Mと2.7Mの試料では、光を当てた試料の結晶が大きさに違いが見られた。光を当てた試料の方が大きくなった。複数の結晶のサイズを測定し、サイズの分布をグラフ化したところ明らかに分布が大きい方へ移動した。
この理由を考察した。膜タンパク質は金ナノ粒子の表面に吸着し、表面上を拡散している。ギャップモードのプラズモン共鳴が生じたとき、ナノ粒子の間に増強電場が発生する。この電場により光ピンセット効果が生じ、表面拡散したタンパク質分子がギャップにトラップされ濃縮される。このギャップが濃厚な環境になり結晶化が始まると考えられる。結晶のサイズが大きくなったのは、結晶化する場所が限定され、大きくなったと考えられる。この結果から、膜タンパク質の光誘起結晶化が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
順調に進展した。
この研究を始める前に水溶性タンパク質の光誘起結晶化の研究を行ってきた。2013年頃光誘起結晶化の機構は、タンパク質の光反応によるタンパク質二量体の生成がきっかけとなり、これを元にして結晶核が形成される機構を考えていた。その後、金ナノ粒子を加え光を当てると結晶化が促進される実験結果を得た。光化学反応が起こらなくても光を当てると結晶化する結果が得られ、反応ではない機構があることがわかった。この機構は金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴による、光ピンセット効果であった。特に金ナノ粒子のギャップモードの表面プラズモン共鳴を誘起すると結晶化が著しく促進されることがわかった。この現象を利用した「タンパク質光誘起結晶化プレート」を開発し、富士フイルム和光純薬から販売された。
この効果を膜タンパク質で実現する研究に取り組んだ。膜タンパク質は水溶液に溶解しないので別の媒質として脂質を用いた。この方法二つの結晶化の方法を試みた。一つは、脂質の相転移を光で行う方法である。タンパク質の結晶化は脂質が立方相からラメラ相へ相転移しラメラ相で起こるとされている。光で構造変化する化合物を用いて相変化を誘起した。しかしながら、脂質が相変化しても膜タンパク質は結晶化は誘起されなかった。
二つ目は、金のプラズモン共鳴による光ピンセットの効果を用いたものである。この方法で光誘起結晶化した。論理的に結晶化の方法を試し、結晶化に成功した。実験の再現性を確かめるために3回の実験を行って、いずれも同じ結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質の光誘起結晶化に成功した。この研究が注目され、ドイツのメルク社が実用化をしたいとオファーがあった。金のナノ構造の研究は日本の田中貴金属と共同研究を行い、今までに研究してきた中で最高性能を発揮できるものが作成できた。しかしながら、タンパク質の構造解析は、結晶を作りX線結晶構造解析を行う方法が最も進んだ方法ではなくなってきた。クライオ顕微鏡が発明され、タンパク質一分子でも構造がわかってしまう時代になった。田中貴金属はこのことを知り、タンパク質の結晶化の共同研究から退いた。メルクも実用化しなかった。膜タンパク質の構造解析の一番の問題は結晶化の困難さではなく分離・精製であるというのが、膜タンパク質研究者の見解である。一つの研究の時代が終わったと考えた。タンパク質の結晶化の研究をこれ以上新しく進めるのはいったん中断することにした。
この方法を用い、タンパク質でないより小さな分子の結晶化に取り組んだ。その結果、いくつかの分子で結晶化が確認された。結晶化は全く別の機構で起きていた。この成果を国内の学会で発表したところ、複数の製薬企業から共同研究のオファーがあった。いずれの企業も製品の結晶化に苦心していることが分かった。
また、混合物の溶液を結晶化させると溶質が金の薄膜上で結晶化するが、溶質ごとに別の場所で別々に結晶化することが判明し、分離・精製の新しい方法として使える可能性があることがわかってきた。さらに、未飽和溶液でも結晶化する実験に成功した。
金のナノ構造を用いた小さな分子の結晶化は新しい現象の発見を示しながら、発展する可能性を示しており、今後の研究を進めることとした。
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| Causes of Carryover |
学術論文の投稿が済んでいない。論文の投稿費用として英文校閲等に30万円を計上した。
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