2019 Fiscal Year Research-status Report
光活性型蛍光分子の多段階多光子過程を利用した蛍光顕微鏡の開発
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19K05312
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
須田 亮 東京理科大学, 理工学部物理学科, 教授 (80250108)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 蛍光顕微鏡 / 光活性型蛍光分子 / 多光子励起 / 逐次的過程 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年の二光子蛍光観察技術の発展は目を見張るものがあるが、二光子顕微鏡においても背景光の発生が深部観察の障害となり、観察可能な深さが制限されている。すなわち、試料の表面近傍で発生する背景光の強度が、目的とする深部からの信号光を上回ることが深部観察を制限する要因である。本研究課題では、二光子励起顕微鏡において蛍光標識となる蛍光分子に光活性型蛍光タンパク質を用い、二段階の二光子過程、すなわち逐次四光子過程として蛍光発光させることにより、背景光を十分に抑制した高解像度の深部観察を実証することを目的とする。
まず、従来法において背景光の発生は励起光のパルス幅に依存することを見出した。マウス脳を模擬した試料では、120 fsの励起パルスより 8 fsの励起パルスで観察した方が到達深度が30%ほど大きくなり、これは、同じ深さを観察するにあたり励起光の平均パワーを１桁低くしても済むという結果である。また、蛍光プローブの褪色を抑制する上でも画期的である。光活性型蛍光タンパク質については、二光子励起スペクトルと二光子光変換スペクトルの取得を行い、短パルスを用いたときの励起効率を詳細に検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
二光子顕微鏡においては背景光の発生が深部観察の障害となり、観察可能な深さが制限されている。すなわち、試料の表面近傍で発生する背景光の強度が、目的とする深部からの信号光を上回ることが深部観察を制限する要因である。今年度、我々は背景光の発生は励起光のパルス幅に依存することを見出した。マウス脳を模擬した試料では、120 fsの励起パルスより 8 fsの励起パルスの方が到達深度が30%ほど大きくなり、同じ深さを観察するにあたり励起光の平均パワーを１桁低くしても済むという結果である。これは、蛍光プローブの褪色を抑制する上でも画期的である。
したがって、本研究の狙いである光活性型蛍光タンパク質を用いた背景光の抑制を議論する前に、比較の対象となる従来法を含めて、励起光のパルス幅依存性を把握することが重要となった。光活性型蛍光タンパク質の利用が優位であることに疑いはないが、定量的に評価する上で必要不可欠である。そのようなことから、光活性型蛍光タンパク質については、二光子励起スペクトルと二光子光変換スペクトルの取得を行い、短パルスで励起したときの励起効率を見積もった。二光子光変換スペクトルの測定は十分ではないが、実験の再開とともに修正可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、光活性型蛍光タンパク質の二光子光変換スペクトルの測定について再実験を行い、今年度に取得した二光子励起スペクトルの結果も含めて、広帯域スペクトルをもつ超短パルスを用いて励起する施策を検討する。すなわち、深部観察を行う上での戦略の見直しとして、試料の深部を観察するにあたり表面近傍で発生する背景光をどこまで抑制すれば良いか把握できるようになったため、短パルス励起の効果と合わせて、励起波長の切り替えをどのように行うべきか検討する。その結果をもとに、空間光変調器による励起波長の切り替えを実施する。
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| Causes of Carryover |
昨年秋、レーザー装置に不具合が生じたため、修理・点検に出すこととなったが、国内では原因が明らかとならなかったため、製造会社の本社工場のある英国に送り返した。結果として、修理が完了する前にコロナ禍により製造会社の活動が停止し、保留となったまま年度をまたぐこととなった。そのため、周辺機器の購入に充てるつもりでいた分を次年度使用としたことが理由である。
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