Fluorescence microscopy using multi-step multi-photon processes of photoactivatable fluorescent molecules

2021 Fiscal Year Final Research Report

• Project/Area Number: 19K05312
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 30020:Optical engineering and photon science-related
• Research Institution: Tokyo University of Science
• Principal Investigator: Suda Akira 東京理科大学, 理工学部物理学科, 教授 (80250108)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 蛍光顕微鏡 / 光活性型蛍光分子 / 多光子励起 / 逐次的過程 / 深部観察

Outline of Final Research Achievements

In deep observation using two-photon excitation microscopy, the depth of observation is limited by the background light generated as out-of-focus fluorescence. In this research, few-cycle pulses with a pulse duration shorter than 10 fs were used as the excitation light to suppress out-of-focus fluorescence and extend the depth of observation. In addition, we attempted to suppress the background light by emitting fluorescence as a sequential multiphoton process using a photoactivatable fluorescent protein as a fluorescent label. In order to verify the depth of background light from the sample surface, fluorescent beads stained with the photoactivatable fluorescent protein were newly developed for embedding in agarose gel as a scattering tissue specimen.

Free Research Field

光工学および光量子科学関連

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

深部観察の障害となっている主な要因として、生体組織による励起光および蛍光の散乱、背景蛍光の発生などがあげられる。本研究では、焦点外蛍光の発生が励起光のパルス幅に依存することを見出した。マウス脳の深部観察において、120 fsの励起パルスよりも 8 fsの励起パルスで観察した方が到達深度が30%ほど大きくなり、これは同じ深さを観察するにあたり励起光の平均パワーを1桁低くしても済むという結果であり、蛍光プローブの褪色を抑制する上でも画期的である。また、光活性型蛍光タンパク質を用いた到達深度の伸長では大幅な改善が得られなかったものの、暗状態試料の作成と使用方法において多くの知見が得られた。