2019 Fiscal Year Research-status Report
Developement of real time cytosensing based on amino acid residues
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19K05529
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| Research Institution | Maebashi Institute of Technology |
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Principal Investigator |
菅原 一晴 前橋工科大学, 工学部, 教授 (30271753)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Impedance measurement / K562 cell / Collagen / THP-1 cell / Myelopeptide / Voltammetry |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞認識/電子伝達性/ペプチド固定化用架橋剤機能を有するペプチド修飾コラーゲン膜被覆電極によりターゲット細胞の電気化学的センシングを実施した。細胞認識ペプチドは、骨髄起源のペプチドでありヒト白血病細胞株(K562細胞)のレセプタと相互作用して分化をもたらす。電子伝達性ペプチドは電極活性物質から電極への電子移動アクセシビリティを改善し、コラーゲン膜に固定化する架橋剤としてオリゴアラニンを用いた。キサシアノ鉄酸イオンの酸化還元応答をコラーゲン膜のみで被覆した電極と細胞認識/電子伝達性ペプチド/コラーゲン被覆膜電極とで比較したところ、ペプチド修飾電極でヘキサシアノ鉄酸イオンの可逆性と電流値が改善された。数十個/mLのK562細胞を添加した場合、細胞認識ペプチドとの結合により電子移動アクセシビリティが抑制され電流値が減少した。それに対して、電子伝達ペプチド修飾コラーゲン膜被覆電極では細胞が共存しても電流値の変化は認められなかった。また、オリゴアラニンを導入した際、ペプチドと細胞との結合が容易となり細胞の検出感度は向上した。この現象に基づいて電気化学インピーダンス分光法測定では電子移動抵抗の変化が明確となるためK562細胞のセンシングができることを見出した。
一方、ヒト急性単球性白血病由来細胞(THP-1細胞)においては単球走化性タンパク(MCP-1)を構成する幾つかの特定のペプチド配列を選択し、それらのペプチドに電子伝達性ペプチドを導入し電子移動抵抗を測定した。その際には、二酸化炭素インキュベータに測定セルを設定して、リアルタイムで計測した。Fox らの報告(J. Med. Chem. 2002, 45, 360-370)と同様な結果が得られている。測定本手法で用いられたペプチドとコラーゲンはアミノ酸残基から成っており環境負荷が小さく生体適合性の高いシステムとなっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的に掲げた「タンパク質やペプチドを細胞培養の足場とし、細胞認識/情報伝達部位から成るペプチドを足場に固定化する。」については、基本的なコンセプトとしては十分にクリアした。K562細胞に対しする細胞認識ペプチドは調節ペプチドであり分化を誘発する機能を示す。THP-1に使用したペプチドはMCP-1を構成するペプチドであり走化性ペプチドを選択した。足場として使用されるコラーゲンに、そのリジン残基を介して細胞認識/電子伝達性/固定化用の架橋剤としてのペプチド修飾を達成した固定化用ペプチドにはオリゴアラニンを選択し、そのペプチドが存在する、しない場合の差異を見出している。オリゴアラニンを架橋剤として使用した際には、細胞とペプチドとの結合が促進されターゲット細胞の検出感度を改善しオリゴアラニンの残基数に関しては5残基程度が適切であることを見出している。また、細胞認識/電子伝達性/固定化用の架橋剤としての機能を有するペプチドとコラーゲンはアミノ酸残基から構成されており、考案したターゲット細胞の電気化学的センシングシステムは環境負荷が小さく、生体適合性が高いセンサといえる。
「細胞インキュベータ内で細胞から引き出される情報を測定するシステムを開発する。」については、2019年度に購入して小型インキュベータを中に小型ポテンショスタットと電気化学的測定セルを設置しBluetooth制御によりリアルタイムでの測定を実現としている。現在は、培地とリン酸緩衝液の混合比を変えることで細胞培養あるいは細胞が生存し、電気化学的測定ができる条件の検討を行っている。今後は、本測定システムでは、電気化学的インピーダンス分光学的測定は困難であることから、小型測定システムを準備することも計画もしている。さらには、細胞からの分泌物をリアルタイムで検出するシステムの構築を視野に入れた研究を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の推進方策としては、これまでの成果を踏まえ以下の計画を遂行する。
細胞認識/電子伝達性/コラーゲンに固定化するための架橋剤としてのペプチド修飾電極によるターゲット細胞のセンシングの有用性が見出されたのでリアルタイムでの電気化学的インピーダンス分光法による測定を行う。本実験で用いている小型ポテンショスタットでは電子移動抵抗の測定は難しいため、新たな小型ポテンショスタットを用意し細胞の検出を試みる。ターゲット細胞としては2019年度にいくつかの知見が得られたTHP-1細胞を選択し、細胞認識ペプチドであるEICADPKQKWVQYYYYC、KQKWVQYYYYC、EICADPYYYYC、WVNYYYYCをコラーゲン膜に固定化する。その際には、培地とリン酸緩衝液に混合比を変化させ細胞培養可能な比率、細胞が生存可能な比率を明らかにする。
グラッシーカーボン電極基板にコラーゲンをキャストしたコラーゲン被覆電極を作製した技術と知見を応用して酸化スズインジウム電極やPedot電極をコラーゲン膜被覆する。細胞認識ペプチドとターゲット細胞との相互作用を培養後には細胞認識/電子伝達性/コラーゲンに固定化するための架橋剤としてのペプチド修飾電極を共焦点レーザ走査型顕微鏡に取付け生細胞・死細胞染色試薬を加えた後、細胞を観察しペプチドの濃度や培養時間の効果を評価する。
電子伝達性/細胞認識/電子伝達性ペプチドプローブ固定化Au thin-layer電極を構築してK562細胞の検出を行う。N-、C-末端にシステイン残基を導入しCYYYY/ FRPRIMTP/YYYYC
ペプチドプローブをAu thin-layer電極表面に固定化する。細胞との相互作用によりオリゴチロシンの電極応答の変化が期待される。コントロールとしてFRPRIMTP/YYYYC固定化電極も作製しその挙動と比較する。
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Research Products
(9 results)
