2019 Fiscal Year Research-status Report
Novel method for indentifying disulfide-linked proteins using hydrogen radical
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19K05530
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
高山 光男 横浜市立大学, 理学部, 教授 (10328635)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 水素ラジカル / 質量分析 / ジスルフィド結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題、複数のジスルフィド結合（S-S）を含む翻訳後修飾タンパク質のアミノ酸配列およびS-S結合部位の情報獲得の新手法開発、に対して、牛乳由来のS-S結合含有タンパク質であるαラクトアルブミンとβラクトグロブリンの分析に着手し、国際学術誌への論文発表および学会発表を行った（研究発表の項参照）。本研究課題は、４本のS-S結合を有するαラクトアルブミンへの水素ラジカル照射の実験からスタートした。その際、S-S結合部位での分解効率が不連続的に低下することで分解スペクトルシグナルも不連続に低下することに注目した。上記２種のタンパク質に適用した結果、S-S結合部位での明確なシグナル低下が観測され、S-S結合部位の情報獲得に成功した。本研究の実験基盤である紫外レーザー光照射によって水素ラジカルを発生する機能を有する試薬に利用により、発生した水素ラジカルがS-S結合部位およびペプチド主鎖のアミドカルボニル酸素に結合、続いて還元チオール化（-SH HS-）反応とペプチド主鎖のN-Ca結合の分解反応が同時に進行することを実験的に確認した。本研究の目的である主要反応を確認できた。本研究の解決課題である各分解反応の収率比較であるが、水素ラジカルの発生源であるアニリン性アミノ基とフェノール性水酸基が、結晶試料の段階でタンパク質分子の表面からS-S結合部位および主鎖アミドのカルボニル基が露出して水素結合を形成することが、反応速度の律速であることが示唆された。これは分解反応の収率向上の実験的理論的戦略を立てる上で重要な示唆となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要に述べたように、すでに２種の当該タンパク質を用いてアミノ酸配列情報とS-S結合部位の情報を共に得ることに成功した。S-S結合の位置情報の厳密な決定には至っていないものの、反応機構がタンパク質分子の表面から露出した部位と水素ラジカル発生試薬との水素結合に大きく関わっている示唆を得たことは大きな進展と考える。分解反応の収率向上の機構に迫る示唆を得たことで、より具体的な実験手順を構築することが可能になった。
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| Strategy for Future Research Activity |
紫外レーザー光照射による強い水素ラジカル発生試薬であるアニリン性アミノ基含有化合物とタンパク質分子表面からの分解露出部位との相互作用を増加させるために、S-S含有タンパク質の変性を進める。この目的のために、従来手法であるチオール還元試薬を用いるが、多種の試薬があることや、試薬の使用条件などには多くの組みあわせ（溶液中での反応時間、濃度、温度など）があるため、本実験手法の特徴である真空条件下での反応に適合するシステムを構築する。また、分子表面を定義可能なタンパク質試料だけでなく、分子サイズの影響を調べるためにS-S結合含有ペプチドをモデルとして用い、分解効率と分子サイズの関係を調べる。また、水素ラジカルの関与は付加反応だけでなく引き抜き反応も生じるため、水素ラジカル関与の反応を総合的に観察し、新規反応の発見にも同時に注力する。
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| Causes of Carryover |
消費税による端数のため。
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