2021 Fiscal Year Annual Research Report
Novel method for indentifying disulfide-linked proteins using hydrogen radical
| Project/Area Number |
19K05530
|
|---|
| Research Institution | Yokohama City University |
|---|
Principal Investigator |
高山 光男 横浜市立大学, 理学部, 教授 (10328635)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 水素ラジカル / ジスルフィド結合 / タンパク質 / 酸加水分解 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
複数のジスルフィド結合を有する同族タンパク質、卵白リゾチーム（HEL）と牛αラクトアルブミン（αLA）の分解特性を比較検討した。HELとαLAは、二次構造と三次構造の類似性が極めて高く、どちらも分子内に4本のジスルフィド結合（S-S）を持つ安定なタンパク質である。複数のS-S結合はその活性と深く関連する三次構造を維持する構造安定性に寄与する一方、酵素や試薬に対する耐性がアミノ酸配列解析を含む構造解析を困難にしている。本研究では、水素ラジカルを攻撃試薬として、主鎖N-C結合のラジカル開裂および同時にS-S結合の還元チオール化による迅速なアミノ酸配列解析をアミノ末端から６０残基まで達成しただけでなく、S-S結合の耐性に基づいた不完全分解がS-S位置の決定に有用であることを見出した（ACS Omega 2019報告済み）。さらにS-S結合の還元を促進するジチオトレイトール（DTT）による処理により、HELもαLAも副次反応なしでアミノ末端から８０残基まで迅速な配列決定を可能にした。
上記の結果は本研究課題を達成できたことを示すが、研究途上、HELとαLAには酸試薬に対する耐性に決定的な差異があることを発見した。すなわち、トリフルオロ酢酸（TFA）の添加はαLAをアミノ酸残基特異的（Asp-Xxx, Xxx-Ser/Thr, Gln-Xxx, Xxx-Gly, Gly-Xxx）に加水分解するのに対し、HELは全く反応せず酸に対する強い耐性を示した。HELとαLAの酸に対する耐性の違いは、HELが塩基性タンパク質であるのに対しαLAは酸性タンパク質であることに帰することができ、その反応機構を提出した（Biochem.Biophys.Reports 2022報告）。
|
