2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of electrochemical gene detection method using small molecule ligand
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19K05534
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
武井 史恵 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 進学課程, 准教授 (30252711)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | PCR / DNA / EIS / DNA結合分子 / 炭素電極 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、申請者の独自技術であるDNAの特殊構造に特異的に結合する“小分子リガンド”を使った遺伝子蛍光検出法を基盤とし、新たに電気化学的な手法を用いた高選択的な高感度生体分子計測法を構築することを目的として、昨年から研究を始めた。電気化学的手法としてインピーダンス(EIS)を用い、DNAと小分子リガンドの相互作用の変化を電気シグナルとして検出する方法の開発を目指し、昨年は小分子リガンドを固定化した電極の開発と基本原理の実証を行った。本年度は昨年度得られた知見を基に、さらに基本原理の詳細を明らかにするための実験を行なった。
我々は炭素電極上にあるOH基に着目し、このOH基に小分子のカルボン酸誘導体を固定化することを考え、小分子のカルボキシ基を酸塩化物に変え、エステル結合で小分子を導入した。EIS法によって抵抗値を測定すると固定化前後で抵抗値の大きさが変化し、小分子が固定化されていることが示唆された。またこの電極を使ってPCR前後の溶液中のDNAを測定したところ、PCR前の二本鎖DNAが存在しない溶液に比べ、PCR後の二本鎖DNAが存在している溶液の抵抗値の方が大きく、この方法によって二本鎖DNAの検出が可能であることが示された。しかしながらこの時、電極を鏡面処理するとシグナルの変化が小さくなった。これは鏡面処理したために、電極上のOH基の数が減少したためと考えられる。一方、鏡面処理しない場合では、シグナルが減る傾向が見られた。これらのことから、炭素電極上の処理が重要であり、鏡面処理の方法、リガンドの結合法についてさらなる検討が必要なことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度は新型コロナウイルス蔓延により、リモートワーク等が強制され大学での実験時間が制限された。また、科研費で実験補助員をお願いする予定だったが、良い人が見つからず、実験が滞った。
予想していた実験結果とは違い、かなり複雑な系であることが判明したため、予想以上に条件検討に時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
EISを用いたPCR法(EIS-PCR法)の開発
今年度の研究でこの炭素電極を用いたEIS測定法は、予想以上に再現性をとることが難しいということが明らかになった。そこで、もう一度電極上の膜の合成、また他の材料の検討等を行い、簡単に再現ができる検出系の構築を目指す。現在はポリピロール膜を使っているが、ポリビニルアルコール、半透膜等を使って検討する。特に温度の上げ下げが必要なPCR法では、材料の安定性を含めた検討が必要となる。
PCR法への応用
少量の遺伝子を感度良く検出するために、現在PCRが用いられている。PCRはDNAの増幅酵素と温度コントロールによって一本のDNAを無数のDNAへと増幅する方法であり、少量の遺伝子の検出感度を格段にあげる。炭素電極を用いた我々の方法では、このPCRの酵素の電極への吸着が問題になることがわかった。そのため、酵素が吸着しないかつ、再現性がある電極の開発を行ったのち、このPCRの進行をEIS法でモニタリングできるかを検討する。具体的にはゲル分析によってDNAが増幅されていることを確認したPCR後の溶液をEIS法で測定し、EISのシグナル変化がPCRの進行に伴う（DNAの増幅に伴う）ものであることを確認する。さらに、テンプレートの濃度を変えてEIS法を使った検出の限界を知り、感度についても検討すると同時に、PCR初期のテンプレート量とEISのシグナルに相関関係ついても調べ、定量PCRの構築を行う。また、PCRの１サイクルごとのDNAの増幅量を測定できるリアルタイムPCRのモニタリングについても検討する。
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| Causes of Carryover |
研究補助員の雇用のための経費を計上していたが、新型コロナウイルス蔓延等で人材確保が難しく、次年度に繰り越した。
次年度は人件費として使用する予定である。
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