2019 Fiscal Year Research-status Report
近接位で協同的にはたらくバイナリーアプタマーの合理的取得とその自在なプローブ化
| Project/Area Number |
19K05545
|
|---|
| Research Institution | Kumamoto University |
|---|
Principal Investigator |
北村 裕介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (80433019)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝田 陽介 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 助教 (50632460)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 核酸 / アプタマー / 分子協働性 / バイオセンサー / PD-L1 / がん免疫療法 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
1.0E+12の多様性を有する核酸ライブラリーを用い、まずPD-L1に結合しない核酸の除去を目的とした予備選択をPD-L1を固定化した磁気ビーズを用いて通常のSELEX法の手順にて行った。次に、合成したアントラセンカルボン酸活性エステルと5’末端アミノ化フォワードプライマーとのカップリングにより、フォーワードプライマーにアントラセンを導入した。これを用い、予備選択にて得られた核酸をPCRで増幅することによって、ライブラリーの5’末端にアントラセンを導入した（Ant-Lib）。また、アントラセン活性エステルと3’末端アミノ化抗PD-L1アプタマーとのカップリングにより、3’末端にアントラセンを有する抗PD-L1アプタマー（Ant-PD-L1）を得た。続いてPD-L1上でAnt-PD-L1の近接位に協同的に結合するAnt-Libの取得を試みた。まず、PD-L1とAnt-PD-L1を結合させ（PD-L1は担体等に固定化せず、溶液中で結合させた）、そこにAnt-Libを添加し、30分間37度でインキュベートした。そこに366 nmのLED光を30秒照射した後、ビオチンを末端に有するAnt-PD-L1の相補鎖を加え、アニーリングし、ストレプトアビジンカラムにより精製した。そのPCRによる増幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、目的物と想定される分子量にバンドが確認された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各DNAコンジュゲートの合成を終え、タンパク上での光ライゲーション産物、つまり近接結合したアプタマー対となるものが得られていると想定されるデータを得たため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後、結合親和性や結合位置に関与する淘汰圧を強めながら、この操作を繰り返すことでAnt-PD-L1の近傍位に強く結合しうるアプタマーが取得されると期待される。その後、SPRなどを用い、得られたセカンダリーアプタマーのPD-L1に対する結合定数を求める。連結型バイナリー化により、アプタマーの結合親和性が連結前より向上したことを確認する。協同的認識型バイナリー化においては、両者の近接末端同士にそれぞれFRETドナーとアクセプター（FITC、TAMRAなど）を修飾して用いる。大過剰のマトリックス（BSA、血清培地など）共存下、レシオ分析によってバイナリー検出の高選択性を実証する。機能導入型バイナリー化のモデルとして、アントラセン修飾バイナリーアプタマーの結合親和性が光照射により可逆的に制御できることを実証する。
|
Research Products
(12 results)
-
[Journal Article] A novel cholinesterase assay for the evaluation of neurotoxin poisoning based on the electron-transfer promotion effect of thiocholine on an Au electrode2019
Author(s)
Hiroshi Shimada, Yuki Kiyozumi, Yuki Koga, Yoko Ogata, Yousuke Katsuda, Yusuke Kitamura, Masaaki Iwatsuki, Katsuhiko Nishiyama, Hideo Baba, and Toshihiro Ihara
-
Journal Title
Sens. Actuators B Chem.,
Volume: 298
Pages: 126893
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Generalized Preparation of Two-Dimensional Quasi-nanosheets via Self-assembly of Nanoparticles2019
Author(s)
Ren Cai, Dan Yang, Keng-Te Lin, Yifan Lyu, Bowen Zhu, Zhen He, Lili Zhang, Yusuke Kitamura, Liping Qiu, Xigao Chen, Yuliang Zhao, Zhuo Chen,* and Weihong Tan*
-
Journal Title
J. Am. Chem. Soc.
Volume: 141
Pages: 1725－1734
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Presentation] Fabrication of anti-EpCAM aptamer-modified gold substrate for capturing cancer cells2019
Author(s)
Ayase Tashima, Yuki Kudo, Yusuke Kitamura, Yuta Nakashima, Keiichiro Yasuda, Masaaki Iwatsuki, Yousuke Katsuda, Kenshiro Nakatake, Hideo Baba, Yoshitaka Nakanishi, Toshihiro Ihara
Organizer
The 14th International Student Conference on Advanced Science and Technology (ICAST) Kumamoto
Int'l Joint Research
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] Fabrication of EpCAM aptamer-modified gold substrate and specific capture of cancer cells on it2019
Author(s)
Ayase Tashima, Yusuke Kitamura, Yuki, Kudo, Yuta Nakashima, Keiichiro Yasuda, Masaaki Iwatsuki, Yousuke Katsuda, Hideo Baba, Yoshitaka Nakanishi, Toshihiro Ihara
Organizer
第24回日本化学会九州支部 韓国化学会釜山支部合同セミナー
Int'l Joint Research
