Development of light-mediated splicing system using hyper stable G-quadruplex

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K05686
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 小笠原 慎治 信州大学, 学術研究院理学系, 助教 (50462669)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: G-quadruplex / スプライシング / 光操作

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、光応答性超安定G-quadruplexを使いRNAポリメラーゼが転写する範囲を光照射で切り替える光駆動型擬似スプライシングシステムを開発 することである。前年度に作製した黄色蛍光タンパク質(Venus)と赤色蛍光タンパク質(mScarlet)の発現を切り替える光駆動型擬似スプライシングシステムでは黄色と赤色蛍光のクロストークにより正確な切り替え特性を評価することができなかった。そこで本年度はクロストークがない青色蛍光タンパク質(mCerulean)と赤色蛍光タンパク質(mScarlet)の光駆動型擬似スプライシングシステムを新たに作製した。
初めに無細胞タンパク質発現系を用いて光駆動型擬似スプライシングシステムの性能評価をおこなった。光刺激しなかったサンプルからはmCeruleanの蛍光のみが観察されmScarletの蛍光は観られなかった。一方、反応前に460 nmの光を照射したサンプルからはmCeruleanの蛍光と微弱なmScarletの蛍光が観察された。これは、光駆動型擬似スプライシングシステムが働いたことを示唆する結果である。次にHEK293T細胞へ光駆動型擬似スプライシングシステムをトランスフェクションし細胞内での性能評価をおこなった。光刺激しなかった細胞からはmCeruleanの蛍光のみが観察されmScarletの蛍光は観られなかった。一方、460 nmの光を照射した細胞からはmCeruleanの蛍光と微弱なmScarletの蛍光が観察された。以上のように、細胞内でも駆動する光駆動型擬似スプライシングシステムを構築することができた。