2020 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質翻訳後修飾体のライブイメージングと選択的単離を実現する新規解析法の開発
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19K05691
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
松浦 顕教 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (50836096)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | BiFC / GFP nanobody / 複合体精製 / タンパク質翻訳後修飾 / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、研究代表者らが以前に開発したBiFC/GFP-Trapシステムを応用し、タンパク質ユビキチン化修飾の検出および機能解析を簡便・高精度に行える技術「BiFC/GFP-Trapユビキチン化解析システム」の開発を目的としている。この新規解析法は、タンパク質相互作用検出法であるBiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation)とユビキチン結合プローブのTUBEを組み合わせることで実現可能である。ユビキチン化の標的として、これまでにユビキチン化分子機構の詳細な解析がなされているタンパク質であるIkappaBalphaとp53を用い、本解析システムの適用を試みている。昨年度までに構築したユビキチン結合プローブTUBEと標的タンパク質との組み合わせのBiFCコンストラクトを用い、ユビキチン化シグナルの検出を検討した。これらのコンストラクトを発現させた細胞において、IkappaBalphaのユビキチン化増加刺激、またはp53のユビキチン化阻害剤などを処理した。その結果、いくつかのBiFCコンストラクトの組み合わせにおいて、BiFCの蛍光シグナルすなわち標的タンパク質のユビキチン化が期待通りに変化することがわかった。これらの条件において、ウエスタンブロット法による検証でユビキチン化を示すラダー状パターンのシグナルが検出できた。今後は詳細な条件検討を行い、既存のユビキチン化検出方法と比較して高感度な検出系の構築を目指すとともに、本システムによりユビキチン化修飾に関わる酵素群の同定も可能であるか検討を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年までに作製した、ユビキチン化修飾体の選択的単離に用いるBiFCコンストラクトを用いた解析を進めている。これまでに報告のあるユビキチン化を受けるタンパク質をモデルとして、本研究で構築するユビキチン化体検出システムの検証を実施した。これらのユビキチン化モデルタンパク質については、BiFCコンストラクトを発現させた細胞に既知のユビキチン化を増減させる刺激をあたえることで、BiFCシグナルの変化が確認でき、ウエスタンブロット解析においてもユビキチン化シグナルを検出できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、抗ユビキチン化抗体やポリユビキチン鎖結合リジンを用いた従来のユビキチン化の検出方法と比較して、どの程度感度良くユビキチン化体を検出できているか、定量的に検討することが必要と考えられる。このために、使用する発現コンストラクトの発現量の最適化などの条件検討が必要である。また、モデル標的タンパク質を用いた検討で、本システムがユビキチン化修飾に関わる酵素群の同定にも応用可能であるか検討を進める。
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