2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of quinone cofactor biogenesis in copper amine oxidase on the basis of proton structures and flexibility analysis
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19K05694
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 銅アミン酸化酵素 / 補酵素 / 金属イオン / 酸化反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、銅含有アミン酸化酵素の自己触媒的な補酵素トパキノン（TPQ）の生成反応を対象として、酵素触媒反応に果たす金属イオンの役割の一端を詳細に解明することを目的とし、最終的には人工的な酸化酵素の構築を目指す。今期は、TPQ形成初期反応に形成されると考えられるligand-metal charge transfer（LMCT）中間体の実体を解明するため、まず変異導入実験を行った。LMCT中間体の有無は、TPQ形成初期における400 nm近紫外吸収帯の存在を指標とした。その結果、候補であった４つの変異のうち２つを含む変異体（2M-AGAO）においてLMCT中間体の形成を再現することができた。単一の変異体および他の二重変異体では中間体は形成されなかった。したがって、これら2残基が中間体形成に関与していることが明らかになった。2M-AGAOにおいて、さらに活性中心であるTPQ前駆体Tyr382をPheに置換した変異体や同じく活性中心の一つであるHis592をAlaに置換した変異体を調製しTPQ形成反応を分光学的に追跡した。その結果、中間体もTPQも形成されなかった。すなわち、活性中心以外の部位は無関係で、活性中心のTyr残基やHis残基が中間体形成に関与していることが示された。この他にも、2M-AGAOのフリー状態および嫌気状態における銅結合型結晶のX線結晶構造解析にも成功し、その構造を得ることができた。大型結晶調製が可能な４つの変異を全て含む4M-AGAOにおいては、中性子回折データの取集にも成功している。現在、野生型酵素における同様な構造との比較を行い、構造生物学的な見地からの解析も進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TPQ形成反応におけるLMCT中間体の形成機構の解明に向けて、順調に研究成果が得られており、その手がかりを得ることができているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
中性子構造解析を進め中間体の水素原子座標についても情報をえること、ならびに分光学的な解析によって、より詳細な機構解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
物品費の使用額が想定よりもやや少なかったが、研究の進展は順調であり、大きな問題はなかった。次年度以降の論文印刷費用として積極的に利用する予定である。
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[Journal Article] Neutron crystallography of copper amine oxidase reveals keto/enolate interconversion of the quinone cofactor and unusual proton sharing2020
Author(s)
Takeshi Murakawa, Kazuo Kurihara, Mitsuo Shoji, Chie Shibazaki, Tomoko Sunami, Taro Tamada, Naomine Yano, Taro Yamada, Katsuhiro Kusaka, Mamoru Suzuki, Yasuteru Shigeta, Ryota Kuroki, Hideyuki Hayashi, Takato Yano, Katsuyuki Tanizawa, Motoyasu Adachi, Toshihide Okajima
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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