ストップトフロー共鳴ラマン分光法によるヘム含有2原子酸素添加酵素の反応機構研究

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05698
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 柳澤 幸子 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (60557982)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: stopped-flow / 共鳴ラマン分光法 / 紫外可視吸収分光法 / ２原子酸素添加酵素

Outline of Annual Research Achievements

ヒトインドールアミン2,3ジオキシゲナーゼ1(IDO)は, ヘム酵素として唯一の2原子酸素添加反応である, トリプトファン(Trp)主要代謝経路の最初の反応を触媒する誘導タンパク質である. この酸素添加反応は収支として電子とプロトンを必要としない, ヘム酵素としては特異な反応で, 反応機構全容は不明である. 反応機構を解明する上で反応途中に現れる反応中間体の配位構造と基質構造を検出することが大きな手がかりとなるが、いくつかのステップについて報告があるだけである。そこで本研究では, ストップトフロー共鳴ラマン分光法を用い, これまで検出できていない‘反応の一部始終’を, 振動スペクトルとして検出することにより, IDO反応機構全容の解明を目指している. 酸素を基質とする酵素は酸素に対し高い親和性を持ち、反応開始を制御するためにストップトフロー装置に高い嫌気性が要求される。また、ラマン測定では同位体酸素やTrpを用いてスペクトルを得た上で同位体差スペクトルを計算し、基質に由来するラマンバンドの帰属を行う。さらに、微弱なラマン散乱光から解析可能なスペクトルを得るためには積算が必要である。2019年度において嫌気チャンバーとストップトフロー装置に組み合わせ、嫌気条件下でラマン・吸収スペクトル同時測定に成功した。2020年度においては、ストップトフローラマンに比べてより少量の試料で測定が可能なストップトフロー吸収分光法を用いて測定条件と光源の検討を行った。また解析方法としてグローバルフィッティングを導入した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の予定では2020年度においては測定条件の検討を進める予定であった。実際研究実績の概要にも示した通り、2020年度はストップトフロー吸収分光法を用いて測定条件と光源の検討を行った。また解析方法としてグローバルフィッティングを導入した。グローバルフィッティングの導入により、吸収スペクトル変化をより詳細に解析できるようになった。その結果、本酵素の測定時に一般的に用いられている還元剤ジチオナイトの微量の混在がスペクトルの波形やデータ解析に影響を与えることが判明した。そのため試料の調製方法を改良する必要が生じた。そこでいくつかの改善策を講じた結果、ストップトフローによる混合直前までジチオナイト非存在下で還元型を保ち、再現性ある測定を可能にした。この段階で時間を費やしたため、進捗状況をやや遅れているとした。その後は測定条件の検討を進め、例えば調製済タンパク質試料を重水中と軽水中で測定し得られたデータを比較した。解析により得られる時定数やアンプリチュードスペクトルに差異はなく、酸素添加反応にプロトン移動は含まれない可能性が高いことが示唆された。今後更なる条件検討を行い、異なるスペクトル種を検出すればラマンスペクトルを測定する。

Strategy for Future Research Activity

【2021年度】反応条件を工夫することで、未検出の反応中間体の検出を試みる。昨年度において重水の使用を試みたが、pHの変更などの溶液条件の検討に加えて、基質濃度、また、酸素の通り道に結合されるとされる3IEという化合物存在下 でストップトフロー吸収分光法により酵素反応追跡を行い、未同定の吸収スペクトルが現れる条件を検討する。また、その時の共鳴ラマンスペクトルを測定する。こ の間必要に応じて大腸菌の培養とタンパク質の精製を行う。

Research Products

• [Journal Article] Effect of the Electron Density of the Heme Fe Atom on the Nature of Fe-O2 Bonding in Oxy Myoglobin (2021)
  • Author(s): Yasuhiko Yamamoto, Kazuyasu Hasegawa, Tomokazu Shibata, Atsuya Momotake, Takashi Ogura, Sachiko Yanagisawa, Saburo Neya, Akihiro Suzuki, Yasuhiro Kobayashi, Makina Saito, Makoto Seto, and Takehiro Ohta
  • Journal Title: Inorg. Chem. Volume: 60 Pages: 1021-1027
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.0c03123
  • Peer Reviewed