2019 Fiscal Year Research-status Report
幅の狭いDNA副溝における分子のねじれを利用した蛍光ペプチド核酸プローブの開発
| Project/Area Number |
19K05700
|
|---|
| Research Institution | Nihon University |
|---|
Principal Investigator |
齋藤 義雄 日本大学, 工学部, 准教授 (40385985)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | PNA / DNA / プローブ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、これまでの蛍光DNAプローブの開発で培ってきた核酸塩基や色素のデーターに基づき、細胞内の核酸検出用に応用できるようにデザインした、分子の「ねじれ」の要素を追加した新規環境感応型蛍光核酸塩基の開発を行うものである。さらにこのような概念をペプチド核酸（PNA）プローブへ適用し、新しいコンセプトで作用するプローブの開発を行うものである。研究計画調書に記載されている通り、本研究は３年間で行われる予定である。
PNAは相補的な一本鎖DNAやRNA、特にRNAとWatson-Crick塩基対形成に基づく安定な二重らせん構造を形成することが知られているため、本研究で開発する蛍光PNAプローブの核酸塩基部位の基本的な設計は、DNAプローブを用いた予備実験結果を参考にできると考えている。そのため令和元年度は、新たなPNA プローブの設計にも適用可能なDNAプローブの開発を継続して行った。実際にいくつかのDNAプローブを作成し、それらを用いて塩基識別能の検討も行い、いくつかのプローブで良好な結果を得られている。
また、これまで行ってきた予備実験結果から導き出された核酸塩基の骨格（DNAプローブ開発の過程で得られた分子構造）をPNA骨格に導入し候補となる、分子の「ねじれ」の要素を追加した新規環境感応型蛍光核酸塩基を含むPNAモノマー分子の具体的な設計と、合成ルートのデザイン、検討および実際の合成にも取り組んだ。途中、合成ルートの再検討が必要となり、新たな合成ルートの構築も行った。その結果、ペプチド合成に使用可能なモノマー分子の完成に近づきつつある。目的とするモノマー分子が実際に得られたら、PNAモノマーをペプチド合成法を用いてPNA配列に導入し、さらなる検討を行う予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
先に述べた通り、本研究で開発する蛍光PNAプローブの核酸塩基部位の基本的な設計は、これまでに開発してきたDNAプローブを用いた予備実験結果を参考にできると考えている。そのため令和元年度は、新たなPNA プローブの設計にも適用可能なDNAプローブの開発を継続して行った。実際に新たなDNAプローブを開発し良好な「標的DNA検出能」や「一塩基識別能」を示した分子構造は、そのままPNAプローブに適用できる可能性が高いと考えている。したがって、よりシグナル/ノイズ比(S/N比)の高いDNAプローブを開発することも非常に重要であると考えている。そこで本年度も実際にいくつかのDNAプローブを作成し、それらを用いて塩基識別能の検討を行った。本プローブの設計では、非天然の核酸塩基と色素分子（および色素分子に導入されている官能基の種類）の組み合わせが非常に重要で、この組み合わせが環境応答能に大きな影響を及ぼすことがわかっている。本年度は一つの核酸塩基に対して、色素に種々の官能基を導入したヌクレオシドモノマーを複数合成し、結果の優れたモノマーを用いてDNAプローブの作成を行った。その結果、いくつかのプローブで良好な結果が得られている。
また、予備実験結果から導き出された核酸塩基の骨格（DNAプローブ開発の過程で得られた分子構造）をPNA骨格に導入し候補となる、分子の「ねじれ」の要素を追加した新規環境感応型蛍光核酸塩基を含むPNAモノマー分子の具体的な設計と、合成ルートのデザイン、検討および実際の合成にも取り組んだ。途中、合成ルートの再検討（保護基の選定等）が必要となり、合成ルートの変更も行ったが、現段階でペプチド合成に使用可能なモノマー分子の完成に近づきつつある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究で開発する蛍光PNAプローブの核酸塩基部位の基本的な設計は、これまでに開発してきたDNAプローブを用いた予備実験結果を参考にできると考えている。そのため、令和元年度にも継続して行った、DNAプローブの開発を引き続き行ってゆく予定である。DNAプローブにおいて、候補となるようなS/N比の高い分子構造が見いだされたら、それらをPNAプローブにも導入することで、プローブ開発を加速化させたいと考えている。
また、ペプチド合成に使用可能なモノマーの合成も完成に近づきつつある。目的とするモノマー分子が実際に得られたら、PNAモノマーをペプチド合成法を用いてPNA配列に導入し、さらなる検討を行う予定である。
令和２年度以降、モノマー分子が得られ、PNAプローブに導入することが出来たら、さらなる蛍光核酸塩基の最適化を検討する予定である。予備実験で得られている蛍光核酸塩基は、極性環境だけをモニターする従来の蛍光核酸の性質も兼ね備えていることから、波長の変化する領域が非常に長く、従来技術に比べてS/N比等も格段に向上しているが、発光波長領域が400 nm前後と短いため、現段階での細胞サンプル等への応用は困難である。そこでより長波長側で発光する蛍光色素をもちいた誘導体を開発し、光学特性や塩基識別能について評価を行う予定である。予備実験の結果から、分子の平面性やICT/LE発光特性には、核酸塩基の骨格や導入する蛍光分子、置換基のドナー（アクセプター）性が大きく影響することがわかっており、単に芳香環を大きくするだけでは、合目的な分子は得られない。そこで量子化学計算に基づく分子設計も十分に行い、蛍光核酸およびプローブのデザインと合成を徹底的に行う予定である。
|
| Causes of Carryover |
昨年度は台風十九号による大学浸水のため、長期間、研究を行うことができなかったため、次年度使用額が生じた。研究計画に変更はなく、本年度使用分を来年度用いて、より広くモノマー分子の合成を行う予定である。
|
