2020 Fiscal Year Research-status Report
幅の狭いDNA副溝における分子のねじれを利用した蛍光ペプチド核酸プローブの開発
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19K05700
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
齋藤 義雄 日本大学, 工学部, 教授 (40385985)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | PNA / DNA / プローブ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、これまでの蛍光DNAプローブの開発で培ってきた非天然核酸塩基や蛍光色素データーに関する知見を考慮した上で、これに分子の「ねじれ」の要素を加えた新規蛍光核酸塩基の開発を行うものである。さらに、より実用的な、細胞内で利用できるプローブの開発をめざして、PNA型のプローブ開発を目指すものである。当初の計画調書に記載されている通り、本研究は３年間で行われる。 PNAは相補的な一本鎖の核酸、特にRNAとWatson-Crick塩基対形成に基づく安定な二重らせん構造を形成することが知られているため、本研究で開発するPNAプローブの核酸塩基部位の設計は、DNAプローブを用いた予備実験結果を参考に行ってきた。初年度は、新たなPNAプローブ設計に適用可能なDNAプローブの開発を継続して行い、いくつかのDNAプローブを作成し、塩基識別能の検討をおこなった。その過程で数種の良好なプローブを得ている。また、これまでの予備実験結果から導き出された核酸塩基の骨格をPNA骨格に導入して、候補となる、分子の「ねじれ」の要素を追加した新規環境感応型蛍光核酸塩基を含むPNAモノマー分子の具体的な設計と、合成ルートのデザイン、検討および実際の合成をおこなってきた。これらの結果を引き継ぎ、令和２年度には、候補となる最適な蛍光核酸塩基を見出すことに成功した。候補となる核酸塩基部位を実際にいくつか作成し、光学特性の検討を行い、現段階で最も適すると考えられる部分構造を見出すことに成功している。さらにこの蛍光核酸部位を含むPNAモノマーユニットの合成ルートをデザインし、実際に合成し、最適化に成功した。これによりペプチド合成法に応用できるモノマーユニット合成法をほぼ確立することができた。最終年度では、確立した合成ルートを基に、ペプチド合成を行いPNA配列に導入し、さらなる検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
先述の通り、本研究で開発するPNAプローブの基本となる塩基部位の設計は、従来開発してきたDNAプローブを用いた予備実験結果を参考にできると考えられる。そのため初元年度は、新たなPNA プローブの設計にも適用可能なDNAプローブの開発を継続して行った。実際にいくつかのDNAプローブを作成し、それらを用いて 塩基識別能の検討を行った。本研究のPNAプローブの設計では、非天然の核酸塩基と色素分子（および色素分子に導入されている官能基の種類）の組み合わせが非常に重要となり、この組み合わせが環境応答能に大きな影響を及ぼすことがわかっている。初年度は一つの核酸塩基に対して、色素に種々の官能基を導入したヌクレオシドモノマーを複数合成し、結果の優れたモノマーを用いてDNAプローブの作成を行い、いくつかのプローブで良好な結果が得られている。 また、予備実験結果から導き出された核酸塩基の骨格（DNAプローブ開発の過程で得られた分子構造）をPNA骨格に導入し候補となる、分子の「ねじれ」の要素 を追加した新規環境感応型蛍光核酸塩基を含むPNAモノマー分子の具体的な設計と合成ルートのデザイン、検討および実際の合成にも取り組んだ。令和２年度も初年度に行った研究も継続しつつ、候補となる核酸塩基部位を実際にいくつか作成し、分子で実際の光学特性の検討を行った。そして現段階で最も適すると考えられる部分構造を見出すことに成功した。さらにこの蛍光核酸部位を含むPNAモノマーユニットの合成ルートをデザインし、実際に合成し、最適化に成功した。これによりペプチド合成法に応用できるモノマーユニット合成法をほぼ確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で開発する蛍光PNA（ペプチド核酸）プローブの塩基部位の基本的な設計は、これまでに開発してきたDNAプローブを用いた予備実験の結果を参考とすることが可能である。 したがって、初年度である令和元年度とそれに続く令和２年度ともに、DNAプローブ開発を継続して行ってきた。令和２年度に、これと同時に進めたPNAモノマーユニットの開発により、現段階で最適な核酸塩基構造を見出すことに成功しているが、より最適なものを見出すために、従来のDNAプローブの開発研究も継続して行ってゆく予定である。これまで同様にDNAプローブにおいて、候補となる新しい分子構造が見いだされれば、すぐにPNAプローブにも適用し、最適なプローブ開発を継続したいと考えている。
これまでの研究でペプチド合成に使用可能なモノマーユニットも、現段階で見いだされており、合成もルートもほぼ完成していることから、ペプチド合成法を用いてPNA配列にモノマーユニットを導入研究にも、随時取り組んでゆく予定である。 候補となるモノマー分子（現段階でPNA鎖に導入する候補となる核酸構造）が得られたことから、最終年度では、確立した合成ルートを基に、ペプチドの固相合成法をもちいたPNAプローブの作成を検討して行きたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
初年度は台風十九号による大学浸水のため次年度使用額が生じ、二年目の年度は新型コロナウイルス感染拡大の影響により長期間、研究を行うことができなかったため、同様に次年度使用額が生じた。しかしながら当初の予想以上に研究が進捗し、研究計画に変更はなく、本年度使用分を来年度用いて、ペプチド核酸プローブの合成を予定通り行う計画である。
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