2020 Fiscal Year Research-status Report

プロドラッグ型siRNAを用いたホモ接合体家族性高コレステロール血症治療薬の開発

Research Project

Project/Area Number	19K05702
Research Institution	Osaka University of Pharmaceutical Sciences
Principal Investigator	浦田秀仁大阪薬科大学, 薬学部, 教授 (80211085)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	斯波真理子国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 非常勤研究員 (70271575)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	siRNA / 核酸医薬 / プロドラッグ型核酸 / 還元環境応答型 / ホモ接合体家族性高コレステロール血症 / Apolipoprotein B
Outline of Annual Research Achievements	ホモ接合体家族性高コレステロール血症 (FH)の治療標的となるApoB mRNAを標的とするプロドラッグ型REDUCT修飾ApoB-siRNAの開発にあたり、REDUCT修飾の搭載部位を合理的にデザインする戦略を採ることとし、本年度はApoB-siRNAに関し下記の点について検討を行なった。１）既存の化学修飾によりApoB mRNA発現抑制 (KD) 活性が低下する部位のマッピングアンチセンス鎖を3残基連続で2'-O-Me修飾したApoB-siRNAを網羅的に合成し、in vitroにおけるKD活性を評価し、化学修飾によりKD活性低下が引き起こされる部位の同定を行った。その結果、アンチセンス鎖の5'-末端から3残基連続で2'-O-Me修飾するとKD活性は消失し、13-15および15-17残基の修飾でも有意に活性低下した。さらに、5'-末端3残基について詳細に評価し、5'-末端から2番目の残基の修飾がKD活性の低下に強く影響することが判明した。２）血清中でのendonucleaseによる分解hotspotの同定血清中では3'-exonuclease活性が非常に高いことが知られているが、これは3'-末端を化学修飾することで容易に回避可能であり、むしろsiRNAのin vivoでの活性発現には二重鎖内部を切断するendonucleaseに対する耐性が重要で、化学修飾すべき部位を決定すべく、ApoB-siRNAのendonucleaseによる分解hotspotの同定を行なった。これまでsiRNAの血清中における分解部位の同定が詳細に行われた例は少なく、アンチセンス鎖の5'-, 3'-いずれかの末端を蛍光標識したApoB-siRNAを用いて分解反応条件及び分解物の分析条件について種々検討を行った結果、endonucleaseによる分解hotspotを３箇所同定することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 「研究実績の概要」で記載したように、本研究の遂行にREDUCT修飾ApoB-siRNAを合理的にデザインする戦略を採用することとし、ApoB-siRNAの血清中での分解部位の同定は、これまでsiRNAの血清中における分解部位の同定が詳細に行われた例は少なく、分解反応条件、分解物の分析条件など、検討に比較的時間を要した。一方で、従来型の非プロドラッグ型2'-O-Me修飾がsiRNA活性を低下させる領域の同定は比較的容易に達成でき、概ね予定通りに進捗したと考えている。これにより、従来型の非プロドラッグ型修飾でsiRNA活性が低下しない部位は従来型の修飾を、非プロドラッグ型修飾でsiRNA活性が低下する部位にはプロドラッグ型REDUCT修飾を施したApoB-siRNAの設計が可能になった。
Strategy for Future Research Activity	次年度は、ApoB-siRNAのFH病態モデルマウスを用いたin vivo実験を実施していくため、比較的多量のApoB-siRNAの合成が必要になり、老朽化しているDNA/RNA合成装置に加え、新たな合成装置を本年度導入済みである。とりわけ、アンチセンス鎖はREDUCT修飾、2'-O-Me修飾を施したRNA鎖を、またセンス鎖は、投与量の減量やこれによる毒性の低減も期待し、肝臓へのターゲッティングが可能になるGalNAc (N-アセチルガラクトサミン) 修飾を5'-末端に施したRNA鎖を合成し、in vivo実験に供する計画である。さらに、予備検討の結果を検証し、さらに必要な化学修飾を行ないながら、in vivo実験を進めていく。