2020 Fiscal Year Research-status Report
Lipid-siRNA内包エクソソームを用いた免疫チェックポイント阻害剤の開発
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19K05703
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| Research Institution | Yasuda Women's University |
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Principal Investigator |
久保 貴紀 安田女子大学, 薬学部, 講師 (90435751)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳原 五吉 国立研究開発法人国立がん研究センター, 先端医療開発センター, 特任研究員 (20158025) [Withdrawn]
瀬山 敏雄 安田女子大学, 薬学部, 教授 (90163120)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | siRNA / 免疫チェックポイント / エクソソーム / 脂質 / コンジュゲート核酸 / 核酸医薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題である、「Lipid-siRNA内包エクソソームを用いた免疫チェックポイント阻害剤の開発」において、2019年度はまず各がん細胞における免疫チェックポイント分子(PD-L1とB7H4)の発現の有無とその発現量を調査し、 Lipid-siRNAsによるがん免疫チェックポイントの発現抑制効果を確認した。
これらの結果を基に、2020年度はLipid-siRNAの脂肪酸の種類によるRNAi効果について検討をした。使用した脂肪酸は飽和脂肪酸としてパルミチン酸(C16)やステアリン酸(C18)、不飽和脂肪としてオレイン酸(Ole)やリノール酸(Lio)を用いた。この脂肪酸をPD-L1を標的とするsiRNA(siPDL1)にコンジュゲートした。これらLipid-siPDL1のRNAi干渉効果を検討した結果、いずれのLipid-siPDL1も強い標的遺伝子発現抑制効果が認められ、不飽和脂肪酸であるOle-siPDL1やLio-siPDL1が特に強いRNAi効果を示した。
また、本研究課題である、「Lipid-siRNA内包エクソソームを用いた免疫チェックポイント阻害剤の開発」において、Lipid-siRNA内包エクソソームの強いRNAi活性の確認は重要である。2020年度はこの点においても重点的に研究を行い、Lipid-siRNA内包エクソソームを用いたRNAi効果も検討した。その結果、Lipid-siRNA内包エクソソームは未修飾のsiRNA内包エクソソームよりも強いRNAi効果があることを確認し、極めて低濃度(数pM)でも強い標的遺伝子発現抑制効果を示すことを確認することが出来た。また、効果持続性も長く、Lipid-siRNA内包エクソソームを細胞導入後、96時間以降でも強い標的遺伝子発現抑制効果を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題である、「Lipid-siRNA内包エクソソームを用いた免疫チェックポイント阻害剤の開発」において、これまでに各種がん細胞における免疫チェックポイントの発現の有無および発現量について調査した。その結果、細胞によって発現する免疫チェックポイントの量と種類が異なることが判明した。また、PD-L1に対するLipid-siPDL1およびB7-H4に対するLipid-siB7H4をデザイン・合成し、各がん細胞に対する免疫チェックポイントの発現阻害効果をリアルタイムPCR、共焦点蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーなどで確認した結果、Lipid-siPDL1およびLipid-siB7H4は、強く標的遺伝子の発現を抑制することに成功し、未修飾のsiPDL1およびsiB7H4に比べても数倍高い効果を示した。さらに、siRNAにコンジュゲートする脂肪酸についても飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸の数種類検討した結果、いずれのLipid-siPDL1においても強い標的遺伝子発現抑制効果を確認し、特に不飽和脂肪酸をコンジュゲートしたLipid-siRNAにおいて強いRNAi効果を確認した。
また、Lipid-siRNAをエクソソームに内包させたLipid-siRNA内包エクソソームを作製し、RNAi効果を検討した結果、未修飾のsiRNA内包エクソソームよりも強いRNAi効果があることを確認し、極めて低濃度(数pM)でも強い標的遺伝子発現抑制効果を示すことを確認することが出来た。また、効果持続性も長いことを確認した。
以上の結果より、本研究課題は当初計画した研究計画に沿って順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究において、様々な種類のがん細胞における免疫チェックポイント分子(PD-L1およびB7-H4)の発現の有無および発現量について調査し、また、Lipid-siPDL1およびLipid-siB7H4がPD-L1およびB7-H4の発現を強く抑制していることを明らかとした。さらにコンジュゲートする脂肪酸についても検討した結果、不飽和脂肪酸であるオレイン酸(Ole)やリノール酸(Lio)を結合させたOle-siPDL1やLio-siPDL1について強いPD-L1遺伝子発現抑制効果を確認した。さらに、Lipid-siRNAをエクソソームに内包させたLipid-siRNA内包エクソソームを作製し、RNAi効果を検討した結果、未修飾のsiRNA内包エクソソームよりも強いRNAi効果があることを確認し、極めて低濃度(数pM)でも強い標的遺伝子発現抑制効果を示すことを確認した。
これらの研究結果を基に、2021年度ではOle-siPDL1やLio-siPDL1をエクソソームへ内包させ、より強いPD-L1遺伝子発現抑制効果を達成する。また、これまでに使用したエクソソームはミルク由来のミルクエクソソームであるが、より高活性なRNAi効果を達成するためにがん細胞から分泌されるエクソソームも利用する。がん細胞としては、肺癌細胞株であるA549や胃癌細胞株である44As3を用い、培養条件下でそれらがん細胞から分泌されるエクソソームを回収しLipid-siPDL1のデリバリー材料として活用する。どちらの細胞もPD-L1の発現が高いことをRT-qPCRおよびフローサイトメトリーで確認している。さらに、これらの細胞をマウスに同所移植もしくは異所移植し、腫瘍の増大を認めた後、マウス腹水もしくは血液よりエクソソームを回収し同様にLipid-siPDL1のデリバリー材料をしての活用を検討する。
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| Causes of Carryover |
本研究は研究代表者と１名の研究分担者の計２名で研究を行っており、次年度使用額は 20684円と少額である。研究代表者および研究分担者は当初の計画通り適正に研究費を使用しており、今回の残金は2020年度の研究費使用期限近くに執行した際に、各メーカーまたは代理店の値引き価格によって生じたものである。また、202１年度の研究に適正に使用する。
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[Journal Article] ADAR2 Regulates Malignant Behaviour of Mesothelioma Cells Independent of RNA-editing Activity.2020
Author(s)
Ken-Ichiro Sakata , Kojiro Maeda , Nozomi Sakurai , Shanshang Liang , Seitaro Nakazawa , Kazuyoshi Yanagihara , Takanori Kubo , Hironori Yoshiyama , Yoshimasa Kitagawa , Jun-Ichi Hamada , Hisashi Iizasa
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Journal Title
Anticancer research
Volume: 40
Pages: 1307-1314
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Synthesis of 6-unsubstituted 2-oxo, 2-thioxo, and 2-amino-3,4-dihydropyrimidines and their antiproliferative effect on HL-60 cells.2020
Author(s)
Yoshio Nishimura , Hidetomo Kikuchi , Takanori Kubo , Yuki Gokurakuji , Yuri Nakamura , Rie Arai , Bo Yuan , Katsuyoshi Sunaga , Hidetsura Cho
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Journal Title
Tetrahedron Letters
Volume: 61
Pages: 151967
DOI
Peer Reviewed
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