Positive charge-based electrophoresis for protein complexes

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05704
• Research Institution: Yasuda Women's University
• Principal Investigator: 平野 真 安田女子大学, 薬学部, 講師 (60514172)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 正電荷

Outline of Annual Research Achievements

本研究では金属イオン要求性タンパク質複合体の分離に資する電気泳動法Reverse Native (RN-)PAGEの開発を目的としている。生体内では、酵素などのタンパク質は他のタンパク質等と複合体を形成することで機能が調節されている。そのため、生命現象を統合的に理解する上で、タンパク質複合体の情報は不可欠である。現在、複合体を簡便に分離・分析する手法としてBlue Native (BN-)PAGEという電気泳動法が用いられている。しかし、この方法では前処理で2価陽イオンのキレート剤を添加するため、金属イオンが除かれ複合体は崩壊する。BN-PAGEではタンパク質染色試薬として使用されるクマシーブリアントブルー (CBB) G250をタンパク質複合体に結合させ、複合体に負電荷を付与し陽極への泳動を可能にしている。一方、本研究で開発するRN-PAGEではタンパク質複合体の正味の電荷を正とし陰極側に泳動する。BN-PAGEの成功から、CBB G250は絶妙のバランスで複合体に結合すると言える。そのため、RN-PAGEにおいて、複合体に正電荷を付与する分子はCBB G250の構造を基盤に合成することとした。
初年度は、はじめにCBB G250の負電荷の本体であるスルホン基の改変を試みたが、過酷な反応条件でもスルホン基の脱離やスルホンアミド化は進行せず、比較的分子サイズが大きく、複雑なCBB G250を出発化合物として目的化合物を得ることは困難であることが判明した。そこで、より小さな化合物としてCBB G250の母骨格から改変するルートとさらに小さな化合物を出発化合物としてCBB G250に類似した骨格を組み立て、側鎖に正電荷を付与するルートで候補化合物の合成を進めた。現在、これらのルートにより合成された候補化合物の水溶性等の物性を検証している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究開始当初計画していた最も工程数の少ないCBB G250からの改変ルートによる正電荷化合物の合成は断念を余儀なくされた。しかしながら、他のルートにより候補化合物を複数得ることができており、概ね当初の予定通り計画が進行しているため。

Strategy for Future Research Activity

さらに候補化合物のレパートリーを増やしつつ、合成した化合物の水溶性を検証していく。pHが中性付近の緩衝液中で陰極側に泳動可能か否か明らかにして候補化合物を絞り込む。加えて、タンパク質への結合能を比較する。候補化合物は恐らく色素として機能するのため、タンパク質をNative PAGE後、CBB染色を行うように上記化合物によりゲルを染色し、染色能をタンパク質結合能として評価する。
続いて、糖タンパク質である卵白アルブミンとその糖鎖構造を認識し、カルシウムイオン依存的に複合体を形成するレクチンBC2L-Aを複合体モデルとして、これまでに絞り込んだ化合物が複合体形成に与える影響を検証する。

Causes of Carryover

購入を予定していた物品が年度内に納品されない可能性が高く、年度内の購入を断念したため、次年度使用額が生じた。年度が明け、予定していた物品を改めて購入した。