Positive charge-based electrophoresis for protein complexes

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05704
• Research Institution: Yasuda Women's University
• Principal Investigator: 平野 真 安田女子大学, 薬学部, 講師 (60514172)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 正電荷化合物 / 色素 / タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本研究では金属イオン要求性タンパク質複合体の分離に資する電気泳動法Reverse Native (RN-)PAGEの開発を目的としている。生体内では、酵素などのタンパク質は他のタンパク質等と複合体を形成することで機能が調節されている。そのため、生命現象を統合的に理解する上で、タンパク質複合体の情報は不可欠である。現在、複合体を簡便に分離・分析する手法としてBlue Native (BN-)PAGEという電気泳動法が用いられている。しかし、この方法では前処理で2価陽イオンのキレート剤を添加するため、金属イオンが除かれ複合体は崩壊する。BN-PAGEではタンパク質染色試薬として使用されるクマシーブリアントブルー (CBB) G250をチャージシフト分子として、タンパク質複合体に結合させ、複合体に負電荷を付与し陽極への泳動を可能にしている。一方、本研究で開発するRN-PAGEではタンパク質複合体の正味の電荷を正とし陰極側に泳動する。BN-PAGEの成功から、CBB G250は絶妙のバランスで複合体に結合すると言える。そのため、RN-PAGEにおいて、複合体に正電荷を付与する分子はCBB G250の構造を基盤に合成することとした。しかし、合成したCBB G250類似化合物は水溶性が乏しかったため、前年度までで、水溶性を高めたパラローズアニリン誘導体を新規化合物として9種類合成した。
合成した誘導体が中性付近で正電荷を帯びるか、ろ紙電気泳動で検証したところ、いずれの化合物も陰極側への移動が観察されたことから、いずれの化合物も中性で正電荷を帯びていることが判明した。続いて、RN-PAGEにおいて、タンパク質複合体チャージシフト分子になり得るか検証するため、マウス肝臓から得た非イオン性界面活性剤抽出物と混和し、RN-PAGEを行ったところ、3種の化合物でタンパク質を電気泳動できた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染症の流行による入構制限により、他研究機関で実施予定だった実験が進められなかったため。

Strategy for Future Research Activity

これまでに合成した化合物で、RN-PAGEにおいてタンパク質を電気泳動することはできたが、どの程度の強さで結合するタンパク質複合体まで複合体が保たれた状態かは不明である。そのため、生体内の結合では比較的弱い糖とレクチンとの結合をターゲットに、糖タンパク質である卵白アルブミンとカルシウムイオン依存的に結合するレクチンBC2L-Aとの複合体をモデルとして、RN-PAGEを実施し、評価する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症の影響による入構制限で、他の研究機関において予定していた実験が実施できていないため。