2019 Fiscal Year Research-status Report
Mechanistic Study on Gene Repair Enzyme
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19K05705
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
田中 好幸 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (70333797)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 酵素反応機構解析 / 構造化学 / NMR / X線結晶構造解析 / タンパク質核酸複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子修復は生体の恒常性維持機構であり、その異常はがんの病理とも深くかかわる。中でも、ヒト8-OxoGuanine Glycosylase 1 (hOGG1) は 修復系で中核的役割を果たす酵素である。そこでがん病理の理解および生体の恒常性維持機構の理解に向けて、hOGG1の触媒機構の解明に挑む 。hOGG1の活性残基としては、Lys249(K249)とAsp268(D268)が触媒残基と目されている。しかしこれらの触媒残基の化学的役割については未同定の部分が多い。そこで上記活性残基の触媒機構上の役割の解明を目指し、hOGG1タンパク質と基質DNA複合体についてNMRによる物性解析およびX線結晶構造解析を実施する。
上記の研究目的を受けて、今年度は以下の研究を実施した。1) メカニズム解析を指向したhOGG1変異体の作製: 海外研究協力者のVladimir Sychrovsky博士 (チェコ科学アカデミー) の理論計算によれば、K249は脱塩基反応の際に8oxoG塩基へのプロトン供与体としても機能することが示唆されている。そこでK249を、他のアミノ酸に置換した各種変異体を作製した。各変遺体について活性を調べたところ、大部分の変異体は、不活性であった。なお、活性のある変異体では、pH依存的に活性を持つ変異体が取得できた。2) NMR分光法によるK249残基のプロトン化状態の解析: NMR分光法でK249残基のプロトン化状態を解析するにあたって、K249以外のリシン残基のシグナルが邪魔になる。そこで、K249残基以外のリシン残機をアルギニンに置換した変異体も作成した。本変異体は良好なNMRシグナルを与え、K249残基の迅速な帰属に寄与する。このように今年度の実験で、K249の触媒機構上の役割を解析する準備が整った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の本丸は、hOGG1の触媒機構の解明にある。研究実績の概要に記したように、本研究課題では、hOGG1タンパク質のK249残基の触媒機構上の役割を決定することが、一里塚となる。研究代表者は海外研究協力者とともに、K249残機によるプロトン供与が、触媒機構にとって重要である予想している（理論化学計算）。それにあたり、変異体取得実験で、K249の変異体のうち、活性がpHに依存する変異体を取得することができた。Glycosylase反応にプロトン授受のステップが含まれることを示唆する重要な知見である。さらに、天然型hOGG1における、K249残機の側鎖アミノ基のプロトン化状態を、NMR分光法により直接観測して、プロトン供与残基としてふさわしい構造（プロトン化状態）にあるかどうかを検証することも目指している。その際に、K249残基以外のリシン残基由来のシグナルが、K249残基のシグナル帰属のボトルネックとなっていた。そこで、不要なシグナルを出すK249以外のリシン残基をアルギニンに置換した改変体を取得した。また、本改変体のNMR測定により、リシン側鎖アミノ基のシグナル観測領域から、余分なシグナルを消去できた。これらの実験により、K249残基のシグナルの帰属が容易となった。なおK249由来の側鎖アミノ基のシグナルは、hOGG1単独での測定では確認できなかったが、今後基質DNAとの複合体にすることで、観測できるものと考えている。このように、K249残基の役割を解析するための準備として、変異体を使った実験、および、NMR分光法によるK249残基のプロトン化状態の直接観測の準備が整った。2020年度の実験では、K249残基のプロトン化状態の観測にすぐに入れるため、実験は概ね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度の実験により、pH依存的に活性を持ちうる変異体を取得できた。また、K249残基のNMR分光法による直接観測に適した改変体も取得できた。
上記の実験成果を受けて、2020年度以降においては次に示す研究を実施する。(1) K249残基の触媒機構上の役割解析: pH依存的変異体の酵素学的実験により、プロトン供与ステップが、Glycosyase反応に含まれているかどうかを検証する。さらに、NMR分光法により、K249残基のプロトン化状態を解析する。(2) リアルタイムNMRによるアノマー位立体解析に基づく触媒機構解析: D268の触媒機構上の役割は未確定である。このような背景のもと研究代表者は、D268の触媒機構上の役割として、損傷塩基のリボースのアノマー位にD268残基のカルボキシ基が求核攻撃する可能性を予想している。さらにその他の可能性としてD268が8oxoG塩基脱離後に過渡的に生成するオキソカルベニウムカチオンを静電相互作用で安定化することも考えられる。この機能未同定のD268の役割を明らかにするために、酵素反応をリアルタイムで追跡して反応直後のアノマー位の立体化学を明らかにする。即ち、アノマー位の立体が立体保持型か立体反転型かを決めることで有機化学的に反応機構の同定を試みる。(3) X線結晶構造解析によるhOGG1-DNA複合体の構造決定: 活性残基K249、D268の触媒反応上の役割を明らかにするために、hOGG1の各種変異体と基質DNA複合体の結晶構造解析を行う。加えて、グリコシラーゼ反応の反応中間体の結晶学的構造決定にも挑む。(4) メカニズム解析から得られた触媒機構からSuicide inhibitorの創製を試みる。(5) 実験的に示されたhOGG1触媒機構を量子化学計算によって検証し、確かな触媒機構を提唱する。
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| Causes of Carryover |
今年度途中で、ディープフリーザー（-80度冷凍庫）が修理不能の状態となった。ディープフリーザーは、本研究課題を実施するための基盤装置（組換えタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセルの保管）であるため、本研究費での購入を計画し、その計画のもと支出を行っていた。ところが、大学内の各種事務手続きの都合から、急遽大学の研究費での購入となった。その決定が、年度末にずれ込んだため、ディープフリーザー購入のために残しておいた本研究費が、残ることとなった。
次年度以降は、NMR測定のための安定同位体標識試薬、及び、損傷延期を含むDNA分子の合成等、高額な試薬も必要となる。これらの試薬の購入に研究費を当てていきたいと考えている
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