2019 Fiscal Year Research-status Report

Search for biological active compounds based on culture methods through communication between two microorganisms

Research Project

Project/Area Number	19K05709
Research Institution	Yamagata University
Principal Investigator	塩野義人山形大学, 農学部, 教授 (80361278)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	共培養 / エンドファイト / 玄米
Outline of Annual Research Achievements	糸状菌は多様な化学構造を有する二次代謝産物を生産する。ゲノム解析技術の進歩により、二次代謝産物生合成遺伝子の多くは発現していないことが明らかになっている。すなわち、一株の菌において、我々がまだ知らない新規な二次代謝産物を生産する能力がある事を意味している。二次代謝の生合成に関連する遺伝子群がどのような物質を生合成するのかが、不明な場合にクリプティックという表現が用いられ、未発現の遺伝子をクリプティック遺伝子と言われている。そこで、二次代謝産物を得ることを目的に、異種の微生物間の相互作用を利用した「共培養法」により、クリプティック遺伝子を活性化し、新たな代謝産物を探索する試みを行った。インドネシア産マングローブ植物の内生分離糸状菌株から、TLCの挙動とコロニーの形状、菌体の形態を考慮し、二次代謝活性化の指標に最適な菌株を選別するためにあえて物質生産性が低い40菌株を使用した。これらの菌株をランダムに選別し、PDA上に糸状菌株のPDA断片を植菌し、PDAの中心で2つの菌株の菌糸が接触するようにして培養を行なった。その後、PDA上で菌糸が接触する部分（コロニーの境界線）の色調の変化に着目し、色素生産を指標に菌株のスクリーニングを行ない、その結果、5種類の菌株の組み合わせで色素生産が誘導されていた。それらの菌株を同様に玄米と水で調製した玄米培地上で静置培養し、単培養時と共培養時で生産する物質に違いがあるかをTLCやHPLCを用いて比較した。その結果、共培養した時に赤色色素を生産し、TLCやHPLCによる代謝産物の比較においても、単培養時に比べて共培養時の方が多くの代謝産物が生産されていたことから、この2つの菌株を選択し、玄米培地を用いて拡大培養し、その抽出物から物質探索を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 共培養で、生理活性物質を生産する菌類の組み合わせが見つかったことより、概ね順調に進んでいると判断した。
Strategy for Future Research Activity	TLCやHPLC分析による代謝産物の比較をさらに行う。また、それぞれの一種の菌類の単培養時に比べて、共培養時の方が多くの代謝産物が生産されていること確認する。次にこの中から、2つの菌株を選択し、玄米培地を用いて拡大培養し、共培養の抽出物から物質探索を行い、新規物質の単離と構造決定を行う予定である。すなわち、それぞれの菌株を培地より、新しいPD培地に植菌したのち、25 ℃で培養する。菌糸が十分に生育したことを確認し、これらを種培地として大量培養を行う。続いて、1L容の三角フラスコに100gの玄米と100mlの蒸留水を入れ、オートクレーブ滅菌したのち無菌条件下で種培地を対峙培養するように接種し、25 ℃ で30日間の静置培養を行う。さらに、培養後、培養物をメタノールで一週間抽出し、吸引濾過によって菌糸体及び玄米培地を取り除き、メタノール抽出物を得る。得られたメタノール抽出物を再度TLCとHPLCにより分析し、通常培地と物質生産性を比較し、再現性があるかを確認する。その結果、再現性が確認され複数の二次代謝物を種々のカラムクロマトグラフィーにより精製する予定である。