2020 Fiscal Year Research-status Report
脂質ラフトにおける糖脂質ータンパク質会合体の形成機序の解明
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19K05713
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
花島 慎弥 大阪大学, 理学研究科, 准教授 (50373353)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 糖脂質 / FRET / コレステロール / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脂質ラフト条件下でのガングリオシドGM3上のシアル酸の傾きの角度、シアル酸とEGF受容体の膜貫通部位直上のLys642間の相互作用、GM3脂質と疎水性ヘリックス間の相互作用の３点を、合成化学を駆使して適切なGM3プローブを得て、固体NMRを用いて生体モデル膜条件下で測定をおこなうことで明らかにする。昨年度までは、ガングリオシドと同じセラミド脂質を有するスフィンゴミエリンのコレステロール存在下での膜上での構造変化を固体NMRを用いて明らかにし、アンブレラ効果の分子機構を明らかにした。
当該度は、ガングリオシドGM３とEGF受容体膜ドメインペプチドの相互作用を蛍光プローブを用いておこなった。本研究の結果は、ガングリオシドGM3はEGF受容体膜ドメインペプチドと相互作用することでEGF受容体の単量体を安定化し、下流へのシグナル伝達を抑制することが示唆された。実験はまず、蛍光基を有するEGF受容体膜ドメインペプチドをペプチド合成装置を用いて化学合成した。合成したペプチドが脂質膜中で正しいα-ヘリックス構造をとることはCD測定を用いてを確認した。さらに膜中でのペプチド濃度依存的な自己消光の度合いを評価した結果、EGF受容体膜ドメインペプチドは膜中で二量体をとることがわかった。この二量体化はGM3存在下で部分的に阻害された。そこで、共同研究者より供与いただいたATTO594蛍光標識を有するGM3とEGF受容体膜ドメインペプチド間のFRETを測定し、直接的な相互作用を調べた結果、GM3とEGF受容体膜ドメインペプチドが脂質膜中で相互作用することが観測できた。得られたFRETプロファイルを詳細に解析したところ、この相互作用による安定下はおよそ11ｋJ/molと見積もられた。次年度は脂質膜中でのＧＭ３の構造変化を固体NＭＲを用いて詳しく観測する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛍光標識を有するＥＧＦ受容体ペプチドの合成を達成し、これを用いてＧＭ３との脂質膜中での相互作用を蛍光測定を用いて詳しく調べた。合成したペプチドは疎水性が高く精製が困難であったが、種々条件検討を行った結果、ギ酸を含む緩衝液を用いることで高純度で得られる精製条件を確立した。このペプチド蛍光基は多量体をとると自己消光をおこすが、濃度がある程度より濃くなるとペプチドの疎水性に依存した自己会合が促進されて、実験の再現性が乏しかった。そこで、濃度条件を種々検討し、希薄な条件下でのみ実験の再現性が高いことがわかった。同様の理由で、蛍光ペプチドの濃度を上げてFRET測定をおこなうと再現性が低下したため、希薄濃度で温度を変化させ、van’t Hoff プロットを用いGM3とペプチドの結合を評価した。これらの蛍光実験の結果、GM3は、EGF受容体膜ドメインと相互作用して、EGFの単量体を安定化することで二量体化やさらなる多量体化を阻害し、膜中へのシグナル伝達を抑制する作用機構が示唆された。また、GM3の固体NMR測定の実施に向けて種々の同位体標識GM3の化学合成を進めている。インテグリンとの相互作用解析に向けてGM3部分構造の合成も併せて進めている。この部分構造は、ラクトース供与体とセラミドの脂質鎖を除いた部分をカップリングし、シアル酸部分をCMP-シアル酸と細菌のシアル酸転酵素を用いることで合成を達成した。現在SPR基板上に固定化する条件を検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
インテグリンとGM3の相互作用解析をおこなう。現在、炭化水素鎖を除いたGM3部分構造プローブの合成を達成した。これを表面プラズモン共鳴（SPR）装置に用いる金基板上に共有結合で固定化している。この固定化した基盤を用いて、シアル酸認識レクチンとのSPR測定をおこなったところ、有意な結合が観測された。今後、インテグリンとの相互作用をSPRを用いて調べていく。さらに、飽和移動差（STD）-NMRやTR-NOESYなどの溶液ＮＭＲの手法を組み合わせて用いることで、ＧＭ３とインテグリンの相互作用をリガンド側の情報から詳しく調べる予定である。
ＧＭ３の膜上での固体ＮＭＲを用いた構造解明に向けて、シアル酸部分の重水素標識体を2種類合成し、固体ＮＭＲを測定した。脂質ラフトを模したスフィンゴミエリンとコレステロール含有膜と非ラフトを模したＰＯＰＣ膜中で得られた重水素固体ＮＭＲスペクトルは異なる値をしめした。これを解析したところ、脂質ラフト模したモデル膜中ではシアル酸の配向が変化することが示唆された。現在、さらに標識体の数を増やして測定を進め、精密な膜上での構造解明を目指している。
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| Causes of Carryover |
コロナウイルスの蔓延により、学会が軒並み中止、延期になり学会における発表機会が失われたため、旅費の使用がなかった。また、緊急事態宣言により、在宅ワークとなった期間や時短での勤務も含め、研究室内で研究を実施する期間が限られていたため、研究に必要な消耗品の購入を次年度に実施することとした。
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