2019 Fiscal Year Research-status Report
カリブ海型シガトキシンを認識するモノクローナル抗体を基盤とする微量検出法の開発
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19K05717
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
円谷 健 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00372855)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | モノクローナル抗体 / ハイブリドーマ / シガトキシン / シガテラ / 抗原 / 海洋毒 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カリブ海型シガトキシン(C-CTX)は，米国大西洋やカリブ海域におけるシガテラ食中毒の主要原因毒素である。この地域におけるシガテラの予防には，魚類からのC-CTXの微量検出法を確立することが必要であるが、そのためにはC-CTXを特異的に認識する抗体の作製が必須である。本研究では、低分子ハプテンを免疫することによるC-CTXを特異的に認識する抗体の作製およびこれを用いた微量検出法の開発を目的とする。
1. C-CTX左端構造を認識するモノクローナル抗体の作製：C-CTX左端構造を認識するモノクローナル抗体を作製するため、5環性ハプテン(1)を設計、合成した。1をキャリアタンパク質に結合させ抗原として免疫した。3回免疫後のマウスより摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞とを電気細胞融合により細胞融合して、ハイブリドーマを作製した。その結果、1を認識するモノクローナル抗体を3種獲得した。これらのモノクローナル抗体について、カルチャーバックを用いた大量調製を行い、10 mg以上のモノクローナル抗体を作製することに成功した。
2. C-CTX右端構造を認識するモノクローナル抗体作製のためのハプテンの設計と合成：C-CTX右端構造を認識するモノクローナル抗体を作製するため、5環以上の大きさからなるハプテンを設計し、現在合成中である。
3. シガトキシンアッセイのためのNeuro 2A細胞毒性試験：神経芽腫細胞Neuro 2Aを用いた細胞毒性試験に最適なOuabainおよびVeratridine濃度を決定した。決定した条件を用いて、P-CTX(CTX1B)の細胞毒性の中和について抗CTX1Bモノクローナル抗体である3G8および8H4を用いて検討したところ、それぞれの抗体を単独で使用した場合に比べて、2個のモノクローナル抗体を混合したほうが遙かに高い効率で毒性を中和することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、まず、C-CTXの左端構造を認識するモノクローナル抗体を作製した。また、C-CTXの右端構造を認識するモノクローナル抗体調製のためのハプテンの合成も最終段階まできている。さらに、シガトキシンアッセイのためのNeuro2A細胞を用いた毒性試験に関する詳細の条件を決定することができた。従って、当初の計画をほぼ順調に遂行することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までに得られた結果を基にして、C-CTXの右端構造を認識するモノクローナル抗体を作製する。右端および左端構造を認識するモノクローナル抗体のC-CTXに対する結合活性を評価し、これらのモノクローナル抗体2種を用いて、サンドイッチELISAによるC-CTXの微量検出法を確立する。
1. C-CTX右端構造を認識するモノクローナル抗体の作製：5環性ハプテン(2)をハプテンとして免疫し、C-CTXの右端構造を認識するモノクローナル抗体を獲得する。得られた抗体のC-CTXに対する結合活性を競合ELISA法あるいはSPR法により評価する。十分な抗体の結合が見られなかった場合には環を１つ増やした6環性(H~N環)のハプテンを新たに設計・合成し、これを免疫する。
2. サンドイッチELISA法によるC-CTXの高感度微量検出法の確立：C－CTX左端構造を認識するモノクローナル抗体あるいは右端構造を認識するモノクローナル抗体のいずれかを酵素標識し、これらを用いたサンドイッチELISA法によるC-CTXの検出を検討する。
3. 抗シガトキシン抗体の立体構造解析：それぞれの抗体をパパインで消化し、Fab断片を調製する。イオン交換クロマトグラフィーにより同一の等電点を示す画分を回収し、精製する。精製Fab断片をハプテンと混合し、共結晶を作製する。共結晶についてX線結晶回折測定を行い抗体の立体構造を決定する。
4. 抗C-CTX抗体の毒性中和試験：まず、Neuro-2A細胞株を用いたin vitro毒性試験を行う。致死量以上のC-CTXに様々な濃度の抗体（左端認識抗体、右端認識抗体およびこれらの1:1混合物）を混ぜ、これをNeuro-2A細胞に添加し、24時間後の細胞数をWSTアッセイにより評価する。また、in vivo マウスの毒性中和試験についても検討する。
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[Journal Article] Addressing the Analytical Challenges for the Detection of Ciguatoxins Using an Electrochemical Biosensor2020
Author(s)
Sandra Leonardo, Greta Gaiani, Takeshi Tsumuraya, Masahiro Hirama, Jean Turquet, Nuria Sagrista, Maria Rambla-Alegre, Cintia Flores, Josep Caixach, Jorge Diogene, Ciara K. O’Sullivan, Carles Alcaraz, and Monica Campas
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Journal Title
Analytical Chemistry
Volume: 92
Pages: 4858-4865
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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