2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of algal morphogen biosynthetic machinery from an epiphytic marine bacterium and its heterologous reconstitution.
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19K05724
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
兼目 裕充 徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (10399438)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | サルーシン / 藻類共生細菌 / テルペノイド / 生合成 / 変異株 / 抗生物質 / ヒトエグサ / 分化誘導 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アオサ藻綱ヒビミドロ目に属するヒトエグサ類は、いわゆる「あおさ」や「あおのり」として世界的にも食品需要が高まっているが、環境悪化等に起因する採苗や養殖管理の難しさから本邦の生産量は年々減少している。その一方で、同綱アオサ目のアオサ（食用ではない）はグリーンタイドと呼ばれる爆発的な増殖現象を引き起こし、世界各地の海で問題となっている。このような背景から、アオサ藻綱藻類の生活環を制御する分化誘導因子や共生細菌との関係についての研究は各方面から強く要望されている。近年、これらの海産藻類の葉状体分化を極微量で誘導するメロセスキテルペノイドのサルーシンが、分化誘導の必須成分として藻類共生細菌より見出されているが、この共生細菌においては、なぜ、どのようにサルーシンを生合成しているのかについては全く解っていない。そこで、本研究では、生産細菌が持つ全てのサルーシン生合成酵素遺伝子類を明らかにすると共に、これらの遺伝子の発現制御機構を解明したい。また、生産細菌自体のサルーシン生産能は非常に低いことから、異種発現系において生合成経路を再構築することによって、サルーシンの効率的な大量生産システムの確立へと発展させたい。
当該年度はサルーシン生産能が亢進した生産細菌株の取得および培養培地の検討とサルーシンの微量検出系の確立を行った。細菌類において、数種の抗生物質に対する耐性変異株は、二次代謝産物の生産性の向上を示すことが知られていることから、本共生細菌においても、それぞれの抗生物質耐性変異株の取得を行い、高いサルーシン生産性を示す耐性変異株のスクリーニングを行った。野生株と従来の培養培地を用いた培養に比して、数百倍の生産性を示す変異株と培地の組み合わせを明らかにできた。また、サルーシンを含むサンプルの誘導体化用法の検討を行い、簡便かつ堅牢な前処理方法を確立することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
サルーシン生合成に関わると考えられる候補酵素遺伝子群が、ゲノム上で大きく３領域に分かれて緩やかに分散していると推定できたことから、当初の計画では個々の候補遺伝子のノックアウト株の作出と、これらの逐次培養によるサルーシン生産性の有無の検証を企図していた。平行して進めていた抗生物質耐性変異株からの高いサルーシン生産性を示す変異株のスクリーニングにより、数百倍の生産性を示す複数の変異株と培地の組み合わせを明らかにできたことから、これらのサルーシン高生産株の解析を優先して進めている。サルーシンを含むサンプルの簡便かつ堅牢な定量分析前処理方法の確立については、論文既知のサルーシン誘導体化方法を参考として検討してきた。分解により定量性が非常に不安定であることが明らかとなったため、新たな誘導体化方法の検討により、簡便かつ堅牢な定量分析前処理方法を確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度において、野生株に比して、数十倍から数百倍の生産性を示すサルーシン高生産変異株と培地の組み合わせを明らかにできたことから、今後はこれらの解析を加えることで、生合成のより網羅的な全体像を従来の計画より早く明らかにできると思われる。当該野生株のゲノムシーケンスは既に完了しており、生合成酵素遺伝子群の推定も完了していることから、新たにサルーシン高生産変異株と野生株の遺伝子発現量の差分解析を行うことで、生合成酵素遺伝子群の同定を進める。さらには、これらの遺伝子群の共通プロモーター配列およびシグマ因子の検証、異種細胞での集約的発現による酵素機能の実証とサルーシン生産系の再構築へと進めていきたい。
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| Causes of Carryover |
学会発表旅費として使用する予定であったが、コロナウイルス感染拡大の防止のため、参加予定の学会が開催中止となったことから当該助成金が生じた。次年度では当該年度において新たに得ることのできた変異株について、次世代シーケンサーを用いた発現遺伝子解析を追加する予定であり、当該助成金はこの試薬等消耗品に充てる計画である。
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