2020 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of new principles for gene regulation by RNA editing
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19K05725
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
福田 将虎 福岡大学, 理学部, 准教授 (90526691)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | RNA編集 / ADAR / ガイドRNA / グアニン四重鎖構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、A-to-I RNA編集（アデノシンをイノシンに置換）による新たな遺伝子制御原理を探索することを目的とし、（研究項目1）RNA編集によるタンパク質翻訳に影響を与えるRNA構造体の誘起、並びに（研究項目2）RNA編集による5’非翻訳領域におけるタンパク質翻訳領域の生成に関する研究を行なっている。令和2年度は、主に研究項目1について研究を遂行し、以下の研究成果を得た。まず、これまでに構築したA-to-I RNA編集によりイノシンを含むGq（ICGq）構造を誘起するRNA配列（IcGq形成コア配列）及びIcGqコア変異配列を、ルシフェラーゼ（Luc）mRNAの5’非翻訳領域に挿入した各種レポーターRNA（IcGqレポーターmRNA）を合成した。次いで、合成した各種IcGqレポーターRNAの標的部位を、ADARタンパク質とガイドRNAを用いたRNA編集技術により、高効率に編集できる条件を確立した。また、標的編集部位特異的なA-to-I RNA編集により、長鎖RNA上でもIcGqが誘起できるかどうかを、逆転写反応を利用したRNA構造解析実験（RTストップアッセイ）により明らかにした。また同時に、A-to-I RNA編集により誘起するIcGq構造が逆転写反応を阻害する機能があることを明らかにした。加えて、IcGqが翻訳反応に与える影響を解析するため、in vitro並びに培養細胞内での評価実験の設計及び条件検討を行なった。上記の研究成果より、A-to-I RNA編集によるIcGq構造形成を介した遺伝子発現制御を実証するための実験系を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度終了時までに、A-to-I RNA編集によりICGq構造を誘起する各種レポーターRNAを取得し、ICGqの逆転写反応阻害能を実験的に明らかにしている。また、in vitro及び培養細胞内におけるICGqの翻訳反応に与える影響を解析するための実験系も構築できている。さらに、in vitroにおいては翻訳阻害を示すICGq配列もある程度絞り込みができていることから、当初計画した研究項目1については予定通りに進展している。加えて、研究計画書に挙げた研究項目2についても、A-to-I RNA編集による翻訳領域の生成と下流の遺伝子発現に与える影響を解析するためのレポーターRNAを構築しており、これまでに5’非翻訳領域におけるA-to-I RNA編集が翻訳反応に影響与えるという知見が得られている。
上記の研究進捗状況から、本研究はおおむね順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究項目1については、これまでに得られたICGqレポーターRNAを用いて、ICGq形成による翻訳阻害をin vitro及び培養細胞内で確認する。具体的には、まず、in vitro翻訳反応とルシフェラーゼアッセイを組み合わせた実験により、in vitroにおいてICGqが翻訳反応を阻害するかを評価する。続いて、上記の実験よりin vitroにおいて翻訳阻害を示す配列群については、これまでに樹立しているADAR発現細胞を用いて、培養細胞内におけるICGq形成による翻訳阻害能を評価する。さらに、RNA編集データベースを活用し、生体内でRNA編集依存的にICGq構造を形成する可能性のある配列を探索し、in vitro及び培養細胞内でIcGq形成を確認する。上記研究より、A-to-I RNA編集がRNA構造の誘起を介して遺伝子発現を制御するというモデルを実証する。研究項目2については引き続き、A-to-I RNA編集によるAUA → AUI 変換により、5’非翻訳領域に翻訳領域を生成できるかどうかの検証を行う。RNA編集技術を用いて、これまでに構築したレポーターRNAの標的AUA配列をAUI配列に変換し、in vitro翻訳反応とルシフェラーゼレポーターアッセイによりNlucの発現を確認する。また、Rlucの発光量をRNA編集前後で比較し、新たに生成した翻訳領域が下流の発現に与える影響を評価する。得られる結果より、5’非翻訳領域に生成するAUIコドンの機能を評価する。以上の実験から、A-to-I RNA編集による翻訳領域の生成と下流の遺伝子発現に与える影響を明らかにする。
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Research Products
(3 results)
