2019 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of iron absorption mechanism in mammals by plant-derived iron chelator, the precursor of mugineic acids

Research Project

Project/Area Number	19K05727
Research Institution	Suntory Foundation for Life Sciences
Principal Investigator	村田佳子公益財団法人サントリー生命科学財団, 生物有機科学研究所・統合生体分子機能研究部, 特任研究員 (60256047)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	難波康祐徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (50414123)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	鉄 / ニコチアナミン / 植物性キレート化合物 / 小腸 / Caco-2細胞 / oocytes / phytosiderophore
Outline of Annual Research Achievements	植物性ニコチアナミンによるキレート型鉄輸送機構の全容を解明するために、小腸から吸収された鉄錯体がどこまで鉄を輸送し代謝されるかを検討し、鉄吸収効果を明らかにする。この目的を達成するために、以下の実験を行った。 ①　マウス投与におけるニコチアナミン（NA)による鉄吸収効果の検討：NAを鉄と同時に投与すると、鉄のみと比べてヘモグロビンや血中の鉄濃度に顕著な差はなかったが、脾臓、肝臓、腎臓では投与５時間後の59Fe鉄の取り込み量が有意に高かった。 ②　PAT1を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞(oocytes)でのNA鉄錯体の輸送活性:卵母細胞oocytesにヒトPAT1(proton-amino acid transporter 1)遺伝子を導入し、抗体染色により、oocyte表皮にPAT1が発現していることを確認した。その細胞を用いて、NA-Fe(II)錯体の濃度を変化させて電気生理実験を行った。その結果、輸送活性ミカエリス定数をKm =49.4 μMと決定した。この活性は植物のNA-Fe(II)錯体トランスポーターZmYS1 とほぼ同様であった。 ③　小腸モデルCaco-2細胞のNA-Fe(II)の吸収：小腸吸収モデルであるCaco-2細胞にNA-59Fe(II)および59Fe(II)を添加し、30分後に1 mM EDTAで洗浄した後、細胞内およびbasal側（血管側）の59Feをカウントした。投与濃度100 μMと500 μMではNA錯体によって細胞内の鉄がbasal側（血管側）に排出されやすくなった。また、Caco-2細胞内でNA-59Fe(II)と思われるTLCのバンドを検出した。以上の結果により、細胞でのPAT1によるNA-鉄錯体の詳細な輸送活性を明らかにし、NA鉄錯体投与が鉄のみの投与より鉄吸収濃度が高い組織を見出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 鉄の取り込み実験に使用していたアイソトープ59Feがこれまでパーキンエルマー社の59FeSO4の２価鉄を使用していたが、製造中止になり、代価品が59FeCl3の3価の鉄しか利用できなくなった。還元剤のアスコルビン酸をさらに添加して、これまでの実験結果と比較する必要がでてきた。同じ実験を重複して行わなければいけなかったため、実験結果の検証に時間がかかった。
Strategy for Future Research Activity	植物性キレート化合物ニコチアナミン（NA）と他のキレート剤EDTAとの鉄吸収比較や前年度に引き続き、細胞内でNAが鉄錯体として輸送、吸収されているかを検証する。また、小腸でのNA-鉄錯体排出トランスポーターを同定し、NAによる鉄輸送機構の解明を目指す。そのために、以下の実験を行う。 ① マウス小腸での鉄の吸収比較：59Feのみ、NA-59Fe錯体、EDTA－59Fe錯体を各々投与30分後の小腸上部の各部位における鉄吸収量を比較する。また投与5時間後においてもNA鉄錯体投与群と他の鉄錯体のキレート剤EDTAとで各組織の鉄吸収量も比較する。PAT1遺伝子が高い近位空腸においてNAまたはNA-鉄錯体が検出されるかも検討する。 ② NA-Fe(II)錯体の排出トランスポーターの同定：小腸での吸収に関わるSLC (Solute carrier)ファミリーの中から、プロトン共役型アミノ酸トランスポーター(PAT1, SLC36A1)がNA-Fe(II)錯体の輸送活性を有することを突き止めたので、次に小腸上皮の基底側にあるニコチアナミンおよび鉄錯体の排出トランスポーターを同定する。その候補遺伝子を定量PCRや次世代シークエンサーのトランスクリプリトーム解析により絞り込む。最終的にアフリカツメガエル卵母細胞に候補遺伝子のcRNAをインジェクションし、輸送活性を測定することによって同定する。 ③ ２つのトランスポーターPAT1（NA鉄錯体輸送）およびDMT1（鉄のみ輸送）の小腸での役割：Caco-2細胞やHEK細胞に各々のトランスポーターを過剰発現させ、各々の抗体染色により、発現を確認後、鉄の取り込みおよび排出活性を比較、評価する。