2021 Fiscal Year Research-status Report
構造予測及び活性測定系による双方向アプローチを基盤とした革新的HBV阻害薬の探索
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19K05734
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大崎 恵理子 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (50447801)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | HBV / polymerase / RT / NNRTI |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではポリメラーゼを標的とする非核酸系RT阻害剤の開発を目指す。
ウイルス感染症克服において，ウイルスゲノムの複製に不可欠なポリメラーゼを標的とした阻害剤は強力な治療薬となる。新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の世界的な感染拡大による危機に際して，治療薬候補としていち早く効果が注目されたレムデシビルなどは，いずれもポリメラーゼを標的とした核酸アナログ製剤である。また，C型肝炎ウイルス（HCV）やHIV感染症においては，核酸アナログを含む複数の阻害剤の併用療法により，高い治療効果が得られるようになった。これらのことからも示唆されるように，B型肝炎ウイルス（HBV）感染者からのウイルス排除という目的においてポリメラーゼを標的とした阻害剤は，併用療法を前提とした上で強力な治療薬となりうる。
申請者らはこれまでにHBVポリメラーゼの活性に重要な逆転写酵素（RT)ドメインの高純度精製タンパク質を用いたin vitroアッセイ系を構築し，この系を用いて有望な候補阻害剤を見出した。これらの候補阻害剤についてHBV RTの結合部位を予測し新たな知見を得ることは，RTの活性に重要なドメインの解明やポリメラーゼの作用機序解明に有益な情報をもたらすものと考えられる。そこで，本研究ではドッキングシミュレーションによる候補阻害剤の結合部位予測と，in vitroアッセイ系での実測データの，双方向からのアプローチにより，阻害剤の作用機序の解明を目指す。さらには多剤併用による相乗効果を最大限引き出すために，結合部位の異なる複数の候補薬剤の組み合わせをシミュレーションにより検証し，in vitroアッセイ系でこれを検証，評価する。本研究により，ポリメラーゼ作用機序に基づく新規治療薬の開発における新たな知見が得られることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HBV ポリメラーゼはその発現・精製が非常に困難であるため，HBV発見から約60年経過した今現在まで，結晶構造が解かれていない。そこで，MMLV RTのPDBデータを元に，MMLV RTの活性を阻害した化合物についてドッキングシミュレーションを試みたところ，実際にin vitroアッセイにより阻害効果を示した化合物は高いドッキングスコアを示した。一方，コントロールとして阻害活性を持たない低分子化合物でシミュレーションしたところ，自由結合エネルギーの値は親和性が低いものであったことから，シミュレーションの結果は妥当なものであると考えられた。さらに，HBVポリメラーゼのホモロジーモデルを構築し， in vitroスクリーニングに用いたライブラリを用いてバーチャルスクリーニングを行い，有効性を評価した。興味深いことに，in vitroスクリーニングで同定済みの32個のヒット化合物はいずれもドッキングスコアが-8.0kcal/mol以下と非常に高い親和性を示し，バーチャルスクリーニングの有効性が示唆された。また，これらのヒット化合物の結合部位をドッキングシミュレーションにより分析したところ，32化合物は大きく５つの結合ポケットに分類することができた。
そこで，結合ポケットの異なる2種の化合物を併用してin vitro アッセイにより阻害効果を検討したところ，相加的，あるいは相乗的な阻害効果を示す組み合わせを複数見出した。
また，RTの結晶化に世界で初めて成功し，現在結晶構造解析を試みている。結晶構造が明らかになることで，構造活性相関や阻害剤の作用機序が明らかになり，治療薬開発の重要な知見が得られるものと期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では，in vitroアッセイによる実測値と，シミュレーションによる予測双方向からのアプローチで，より有望なRT阻害剤を探索，同定することを目的としており，当初の想定よりも整合性の高い結果が得られたと考えている。今回，シミュレーションによる阻害剤の結合ポケットが予測されたが，予測に基づく薬剤の組み合わせによる相乗効果を示したものが見出された。このことからこれまではスクリーニング時に除外されていたような，単剤では阻害効果の低い化合物についても異なる結合ポケットに作用する化合物との併用により，相乗効果が得られる可能性も考えられた。HIVの研究では，核酸系RT阻害剤（核酸アナログ）と非核酸系RT阻害剤との組み合わせにより，核酸アナログ単独では阻害効果を示さない薬剤耐性変異株においても，相乗的な効果により劇的な阻害効果を示した例もあることから，既存の核酸アナログと本研究で見出された阻害剤との併用による効果を検討していく予定である。今後更なるスクリーニング（in vitroおよびin silico）を実施し，阻害効果を示す薬剤の骨格構造を明らかになれば，構造展開によってより安全性が高く，かつ阻害効果の高い化合物を創出することが可能となる。また，RTの結晶化に成功したことから，構造活性相関を明らかにすることで立体構造に基づく戦略的な治療薬デザインも可能になると考えられる。本研究で得られた候補阻害剤は，今後セルベースアッセイや動物モデルでの薬剤評価を進めると共に，構造を基盤とした創薬デザインおよび新薬開発を目指す。
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| Causes of Carryover |
当初購入予定であったシミュレーションソフトウェアに変わり，アカデミックフリーのソフトウェアで良好な結果を得たため，引き続き当ソフトウェアを使用予定である。
また，併用効果の評価が想定よりも良好であったため，これらの検証を引き続き翌年度に実施する予定である。
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