2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of small molecule fluorescent compounds and elaboration of fluorescent probe for periodontal bacteria
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19K05740
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
表 雅章 摂南大学, 薬学部, 教授 (90299032)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
軽尾 友紀子 摂南大学, 薬学部, 助教 (30826235)
伊藤 潔 摂南大学, 薬学部, 教授 (50201926)
船曳 一正 岐阜大学, 工学部, 教授 (50273123)
谷 敬太 大阪教育大学, 教育学部, 教授 (60207165)
河合 健太郎 摂南大学, 薬学部, 准教授 (60826246)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 小分子 / 蛍光性化合物 / アニリン / フッ素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の特色は、分子サイズが小さいにもかかわらず水中でも蛍光を発するような蛍光性化合物を探索することである。蛍光団の分子サイズが小さくなると立体障害が抑えられるため、基質特異性の高い酵素についても酵素活性が測定できるような蛍光プローブが開発できる可能性がある。分子サイズの小さな蛍光団としては、蛍光性をもたないアニリンのアミノ基の隣に、3,3,3-trifluoroprop-1-enyl（TFPE：－CH=CHCF3）基をひとつ置換するだけで性質が一転し、アニリンに優れた蛍光性が付与できることを発見している。さらに興味深いことに、この小さな分子は水中でも強い蛍光を発することができ、我々の知る限り、水中で蛍光性を保つ世界で最小の蛍光性化合物であることが分かりつつある。これまでの結果から、アニリンのオルト位にTFPE基を有するTFPE-anilineを基本骨格とし、アミノ基の5位に電子求引性置換基を導入すると蛍光特性が改善し、特に、5位にシアノ基を有する5-CN-TFPE-anilineが極めて優れた蛍光特性を示すことが分かった。2019年度の研究実績として、この5-CN-TFPE-anilineおよび位置異性体4-CN-TFPE-anilineの大量合成を行い、それぞれの励起吸収波長と蛍光スペクトルを測定した。また、様々なTFPE-aniline誘導体を合成し、それぞれの励起吸収波長および蛍光スペクトルを測定して一連の小分子蛍光性化合物（TFPE-aniline）の蛍光特性を報文にまとめた（Y. Karuo, K. Tani, K. Funabiki, K. Ito, K. Kawai, M. Omote J. Org. Chem. 2020, 85, 1253-1258）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は、TFPE-aniline誘導体の合成研究を主に実施した。特に、本研究の鍵化合物である5-CN-TFPE-anilineおよび位置異性体4-CN-TFPE-anilineの大量合成を行った。方法として、anilineから誘導した5-CN-2-iodoanilineまたは4-CN-2-iodoanilineに対して、パラジウム触媒およびフッ化銅の存在下、当研究室で開発したTFPE化試薬（TMSCH=CHCF3）と反応させることで桧山クロスカップリング反応が進行してTFPE基の導入が行え、目的の5-CN-TFPE-anilineおよび4-CN-TFPE-anilineを得ることができた。その他、2019年度は、他のTFPE-aniline誘導体を数種合成し、それぞれの励起吸収波長および蛍光スペクトルを測定した。加えて、蛍光特性が最も優れている5-CN-TFPE-anilineが、実際の酵素反応を追跡する蛍光プローブの蛍光団として機能するかどうかを調べるため、5-CN-TFPE-anilineのアニリン窒素をＬ-アラニンと縮合させたペプチド（Ala-5-CN-TFPE-aniline）を別途合成し、これを加水分解酵素Aminopeptidase N（APN）の酵素基質に用いて酵素反応の前後で蛍光性の変化を測定した。結果として、Ala-5-CN-TFPE-anilineは酵素反応の前は蛍光性を全く示さないが、酵素反応により5-CN-TFPE-anilineが遊離すると強い蛍光性を示し、APNの添加量に依存して蛍光性が増強した。つまり、Ala-5-CN-TFPE-anilineはAPNの蛍光プローブになることを実証した。これらの結果を学術論文にまとめ、報告した。（J. Org. Chem. 2020, 85, 1253-1258）。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、1) 5-CN-TFPE-anilineが水中で蛍光性を示す仕組みの解明、2) 歯周病菌が産生する酵素PTPの蛍光プローブ創製、これら二つの項目に注力する。1) については、これまで2019年度に合成したTFPE-aniline誘導体について、それぞれの蛍光寿命を測定する。特に、想定している5-CN-TFPE-anilineの光励起構造に注視し、Hammettの置換基定数（σ）と蛍光寿命の相関をみることで、一連の化合物が蛍光を発する仕組みを解明したい。光励起過程の差異をみるには分子軌道計算を必要とし、励起状態からの失活（緩和）過程については放射失活および無放射失活の速度定数を実験値から算出する必要がある。これらの実験については、研究分担者の船曳教授（岐阜大学工学部）、谷教授（大阪教育大学教育学部）、河合准教授（摂南大学薬学部）にお手伝いいただき、研究を推し進める。一方、2) については、歯周病菌が産生する加水分解酵素プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（PTP）の酵素活性を測定する蛍光プローブを合成する必要がある。具体的には、5-CN-TFPE-anilineを蛍光団とし、アニリン窒素に、L-アラニン、L-アラニン、L-プロリンを縮合させたAla-Ala-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]を目的の蛍光ローブとする。これに関しては、表および軽尾助教（摂南大学薬学部）が担当し、2020年度の合成完了を目指す。Ala-Ala-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]の生物学的評価は伊藤教授（摂南大学薬学部）が担当し、2021年度の実施を予定している。
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| Causes of Carryover |
当初、本研究で発表を予定していた国際学会の発表内容が別の内容に変更になり、このことから当該の旅費を科研費で充当することをやめたため、旅費分が未使用となった。また、物品費を含む他の経費は、不足することなく当初額の通り執行できたため、当該の旅費分を物品費に補填することなく次年度使用額に充てた。
次年度使用額の2020年度使用計画として、新型コロナウイルスの影響で国際学会および国内の学会が相次いで中止または延期となっており、使用計画がたてにくい状況下であるが、旅費および消耗品への補填を考えている。消耗品に充てる理由として、研究計画にある合成実験に少し遅れを取っているため、これを補完するには試薬類の購入が必要になると考えている。
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[Journal Article] Synthesis of Small Fluorescent Molecules and Evaluation of Photophysical Properties2020
Author(s)
Futa Ogawa, Yukiko Karuo, Ryuji Yamazawa, Kanae Miyanaga, Kazushige Hori, Keita Tani, Kengo Yamada, Yuki Saito, Kazumasa Funabiki, Atsushi Tarui, Kazuyuki Sato, Kiyoshi Ito, Kentaro Kawai, and Masaaki Omote*
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Journal Title
The Journal of Organic Chemistry
Volume: 85
Pages: 1253-1258
DOI
Peer Reviewed
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