Development of small molecule fluorescent compounds and elaboration of fluorescent probe for periodontal bacteria

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05740
• Research Institution: Setsunan University
• Principal Investigator: 表 雅章 摂南大学, 薬学部, 教授 (90299032)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 軽尾 友紀子 摂南大学, 薬学部, 助教 (30826235) ; 伊藤 潔 摂南大学, 薬学部, 教授 (50201926) ; 船曳 一正 岐阜大学, 工学部, 教授 (50273123) ; 谷 敬太 大阪教育大学, 教育学部, 教授 (60207165) ; 河合 健太郎 摂南大学, 薬学部, 准教授 (60826246)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 蛍光性化合物 / フッ素 / アニリン / 小分子 / 酵素活性プローブ / プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ

Outline of Annual Research Achievements

フルオロセインに代表される蛍光団は蛍光性能は優れているものの、分子サイズが大きく、酵素活性を測定する酵素プローブとしての利用には不向きである。蛍光団の分子サイズが大きくなると、蛍光プローブが酵素の活性部位に収まりにく、酵素反応の進行を妨げる。一方、我々が開発した蛍光団は、アニリンを基本骨格とした分子サイズの小さなものである。また、アミノ基の隣に 3,3,3-trifluoroprop-1-enyl（TFPE：－CH=CHCF3）基と、5位にシアノ基を有する5-CN-TFPE-anilineは極めて優れた蛍光特性を示すこと、さらに、水中でも強く光ることを明らかにしており、我々の知る限り、水中で蛍光性を保つ世界で最小の蛍光性化合物であることが分かりつつある。2021年度は、この5-CN-TFPE-anilineを蛍光団に用い、歯周病菌が産生するプロテアーゼの蛍光プローブ創製に取り組んだ。歯周病菌は、加水分解酵素プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（PTP）を産生して活動するが、PTPは基質特異性が高く大きな蛍光団では酵素反応を妨げるため、PTPの酵素活性用蛍光プローブはこれまでに開発されていない。これまでの蛍光団とは異なり、5-CN-TFPE-anilineの小さな分子サイズ、水中で強い蛍光を発する蛍光性を利用すれば、PTPの蛍光プローブが創製できると考え、Gly-Phe-Pro-[5-CN-TFPEaniline]をターゲットプローブとし、それぞれの合成に着手した。酵素基質となるトリペプチドGly-Phe-Proの合成は液相法で行い、適宜保護基で保護し、N末から縮合させた。ジペプチドGly-Pheに対してプロリンを縮合させる段階は立体障害により反応収率が低下するが、縮合剤を工夫することで比較的高収率で縮合反応が進行し、目的のGly-Phe-Proを得ることができた。現在、Gly-Phe-ProのC末に蛍光団（5-CN-TFPE-aniline）を縮合させているところである。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染拡大により、2020年当初から始まった研究活動の規制が、本研究の進捗を大幅に遅らせている。

研究期間内に実施したリガンド－タンパク質ドッキング計算により、トリペプチドGly-Phe-ProがPTPの活性部位に対して極めて高い親和性を示したため、新たに「Gly-Phe-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]」を標的プローブとした。Gly-Phe-Proは立体的な要因で縮合が難しいとされているが、縮合剤をはじめとする反応条件を種々検討した結果、効率のよい合成経路を確立できた。一方で、蛍光物質の5-CN-TFPE-anilineは順調に合成できている。現在、Gly-Phe-ProのC末に5-CN-TFPE-anilineを縮合させている段階だが、5-CN-TFPE-anilineのアミノ基は塩基性・求核性が乏しく、縮合反応が極めて進行しにくいことが分かった。様々な縮合剤を用いて当該の縮合反応を試みているが、目的のGly-Phe-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]は、今のところ得られていない状況である。

Strategy for Future Research Activity

現状の課題は、プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（PTP）の基質であるトリペプチドGly-Phe-Proと、蛍光団5-CN-TFPE-anilineが縮合できないことである。この理由として、プロリンの立体的な影響と、5-CN-TFPE-anilineのアミノ基が塩基性・求核性ともに低ことにより、縮合反応が効率よく進行しないと考えられる。これを解決するため、先ずは、トリペプチド側の保護基を見直す。トリペプチドの保護基にBoc基などを用いており、このような保護基が縮合反応の進行を妨げている可能性がある。同時に、縮合の順序を見直す。つまり、先にプロリンのC末に5-CN-TFPE-anilineを縮合させ、その後、N末側にGly-Pheを縮合する順序である。この順序（反応経路）で、様々な縮合剤を用いて縮合反応の反応条件を詰めていく。また、目的の蛍光プローブGly-Phe-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]が合成できれば、直ちにPTPの活性測定へと移行し、蛍光プローブの妥当性を評価する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染拡大により大学への入構が制限されたため、実質的な研究時間が大幅に削減され、当初予定していた研究内容が実施できなかった。繰越金については、前年度に実施できなかった化合物合成の試薬類およびガラス器具の消耗品、生物活性測定用試薬、蛍光寿命測定用試薬・セルなどに使用する。