2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of small molecule fluorescent compounds and elaboration of fluorescent probe for periodontal bacteria
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19K05740
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
表 雅章 摂南大学, 薬学部, 教授 (90299032)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
軽尾 友紀子 摂南大学, 薬学部, 助教 (30826235)
伊藤 潔 摂南大学, 薬学部, 教授 (50201926)
船曳 一正 岐阜大学, 工学部, 教授 (50273123)
谷 敬太 大阪教育大学, 教育学部, 教授 (60207165)
河合 健太郎 摂南大学, 薬学部, 准教授 (60826246)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 蛍光性化合物 / フッ素 / アニリン / 小分子 / 酵素活性プローブ / プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
分子サイズが小さく、水中でも蛍光性を保つ蛍光団の開発を目指し、これまでに幾つかの候補化合物を合成してきた。なかでも、2位にCH=CHCF3基（TFPE基）、5位にCN基を有するアニリン「5-CN-TFPEaniline」が、水中で発光できる蛍光団として極めて優秀なスコアを示した。通常、蛍光団は有機溶媒中で蛍光性を示しても、水系溶媒中では水素結合により蛍光性が相殺され、光らない。一方、当該の蛍光団は、水系溶媒中の蛍光量子収率が0.89であり、分子サイズからは考えられない蛍光性を有する。この特性を活かすべく、現在、5-CN-TFPEanilineを蛍光団に用いて、歯周病菌が産生するプロテアーゼの蛍光プローブ創製に取り組んでいる。歯周病菌は、加水分解酵素プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（PTP）を産生して活動するが、PTPは基質特異性が高く大きな蛍光団では酵素反応を妨げるため、PTPの酵素活性用蛍光プローブはこれまでに開発されていない。これまでの蛍光団とは異なり、5-CN-TFPE-anilineの小さな分子サイズ、水中で強い蛍光を発する蛍光性を利用すれば、PTPの蛍光プローブが創製できると考え、Gly-Phe-Pro-[5-CN-TFPEaniline]をターゲットプローブとし、それぞれの合成に着手した。2022年度の実績として、ターゲットプローブの合成は達成できた。また、ターゲットプローブを用いてPTP活性測定も実施できたが、選択した基質にアミノ酸配列が適切ではないことが分かり、現在、別のターゲットプローブの合成を行っている。この結果については、「第72回日本薬学会関西支部総会・大会」および「第45回フッ素化学討論会」にてポスター発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ターゲットプローブ「Gly-Phe-Pro-[5-CN-TFPEaniline]」の合成は、適切に保護されたジペプチド「Gly-Phe」に、あらかじめプロリンに蛍光団を縮合させた「Pro-[5-CN-TFPEaniline]」をカップリングする方法により、合成した。つまり、N-Boc-GlyのC末端をBTH化した後にPheと縮合させることで、問題なくGly-Phe部分を合成できた。一方、プロリンと蛍光団の縮合は進行し難く、種々の縮合剤を検討したところ、ProのC末を酸塩化物に変換後、DMAPの存在下で蛍光団を縮合させる経路により、Pro-[5-CN-TFPEaniline]部分を得ることができた。両者の縮合は、Gly-PheのC末をBTH化で活性化することで問題なく進行し、脱保護後、目的のGly-Phe-Pro-[5-CN-TFPEaniline]を得ることができた。同様の手法により、蛍光団にAMCをもつ「Gly-Phe-Pro-[AMC]」も得ることができた。続いて、得られた両蛍光プローブを用いてPTPの酵素活性を測定したところ、蛍光団にAMCをもつプローブは低感度ながらPTPの酵素活性を測定することができたが、蛍光団に[5-CN-TFPEaniline]をもつプローブでは、PTPの酵素活性を正しく測定できなかった。この結果から、両蛍光プローブとPTPのドッキングシミュレーションを行ったところ、Phe-Pro-[5-CN-TFPEaniline]のTFPE基がPheの側鎖と立体的に反発し、AMCの場合に比べてトリペプチド部分が捻じれており、酵素基質としての反応性が低下していることが分かった。このため、新たな蛍光プローブとして、トリペプチドのPheをGlyに置き換えた「Gly-Gly-Pro-[5-CN-TFPEaniline]を新たなターゲットとし、目下合成中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
PTPの蛍光プローブとして、トリペプチド「Gly-Phe-Pro」を「Gly-Gly-Pro」とした新たなプローブを合成する。PheをGlyに置き換えることにより、5-CN-TFPEanilineのTFPE基とPheの立体反発を避けることができ、トリペプチドの捻じれも解消できる。新たなターゲット「Gly-Gly-Pro-[5-CN-TFPEaniline]」はこれまでのものと比べて立体反発が少ない分、合成しやすく、既に確立した合成経路により問題なく合成が可能と考えている。同経路により、AMCを蛍光団にもつ新たな蛍光プローブ「Gly-Gly-Pro-[AMC]」も合成し、両プローブともにPTP活性を測定することで、蛍光団の違いによるプローブ性能を評価する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍で研究が全体的に遅れたため。特に、ターゲット化合物の合成の供給が予定より大幅に遅れ、引き続く生物活性測定が年度内に達成できなかった。残額の554,504円は、ターゲット化合物の合成、活性評価、物性評価の物品費（主に試薬類）に使用する。
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Research Products
(2 results)
