Development of small molecule fluorescent compounds and elaboration of fluorescent probe for periodontal bacteria

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K05740
• Research Institution: Setsunan University
• Principal Investigator: 表 雅章 摂南大学, 薬学部, 教授 (90299032)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 軽尾 友紀子 摂南大学, 薬学部, 講師 (30826235) ; 伊藤 潔 摂南大学, 薬学部, 教授 (50201926) ; 船曳 一正 岐阜大学, 工学部, 教授 (50273123) ; 谷 敬太 大阪教育大学, 教育学部, 教授 (60207165) ; 河合 健太郎 摂南大学, 薬学部, 准教授 (60826246)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 蛍光性化合物 / フッ素 / アニリン / 小分子 / 酵素活性プローブ / プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ

Outline of Annual Research Achievements

現在汎用されている蛍光団のうち、水中で蛍光性を示すものは分子サイズが大きくなり、酵素活性を測定する蛍光プローブとしての利用には不向きである。酵素の基質特異性が高くなると、蛍光団の大きさが酵素反応の進行を妨げてしまう。一方、我々が開発した蛍光団は、アニリンを基本骨格とした分子サイズの小さなもので、3,3,3-trifluoroprop-1-enyl（TFPE：－CH=CHCF3）基とシアノ基を有する5-CN-TFPE-anilineは水中でも極めて優れた蛍光特性を示すことを突き止めた。2023年度は、この5-CN-TFPE-anilineを蛍光団に用い、歯周病菌が産生する加水分解酵素プロリルトリペプチジルアミノペプチダーゼ（PTP）の蛍光プローブ創製ならびに酵素活性評価を実施した。PTPは基質特異性が高く、これまで酵素活性測定用の蛍光プローブは開発されていない。我々は、5-CN-TFPE-anilineを蛍光団に用い、Gly-Phe-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]をターゲットプローブとし、合成を実施した。5-CN-TFPE-anilineのアミノ基は求核性が低く、アミノ酸との縮合反応が進みにくいことが判明したが、種々の縮合剤を検討することで目的のGly-Phe-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]を得た。同様に、蛍光プローブとして、汎用のAMCを蛍光団とするGly-Phe-Pro-[AMC]も比較検討用に合成した。得られた蛍光プローブを用いてPTPの酵素活性評価ならびに酵素－基質ドッキングシミュレーションを繰り返したところ、トリペプチドのアミノ酸配列が不適であることが判明した。具体定には、蛍光プローブのPhe残基と蛍光団が互いにぶつかり合い、酵素基質として不適切なコンフォメーションを取るためである。この知見から、代替となる基質Gly-Gly-Pro-[5-CN-TFPE-aniline]の合成に取り組んだ。