2020 Fiscal Year Research-status Report

粘液細菌を用いた飢餓時でのポリリン酸を介したエネルギー生成の解明

Research Project

Project/Area Number	19K05770
Research Institution	Kagawa University
Principal Investigator	木村義雄香川大学, 農学部, 教授 (10243750)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ポリリン酸 / 粘液細菌
Outline of Annual Research Achievements	細菌はリン酸が直鎖状につながったポリリン酸を飢餓時に合成する。本年度は、ポリリン酸のリン酸をAMPに付加してADPを生成する酵素であるpolyP:AMP phosphotransferase (Pap)とポリリン酸の分解酵素であるPpx1とPpx2の酵素学的諸性質の検討を行った。 Papは、AMPのほかdAMPも基質とし、また、活性は低いがADPも基質とし、それぞれdADPとATPが生成された。リン酸転移供与体としてpolyP60-70を用いた時に最も活性が高かったが、Km値はpolyP700-1000において最も低く、触媒効率(kcat/Km)はpolyP700-1000においてpolyP60-70のそれよりも4倍ほど高かったことから、本酵素は長鎖のポリリン酸を用いてAMPをADPに生成しやすいことがわかった。本酵素の活性は粘液細菌の飢餓時1-2日において約2倍上昇した。また、PapとPpk1の両酵素を用いることでポリリン酸とAMPからADP、さらにATPが生成されたことから、粘液細菌の細胞内においても飢餓時には生成したポリリン酸を用いてAMPからATPが生成されていると推定された。一方、ポリリン酸分解酵素のPpx1とPpx2はそれぞれ短鎖と長鎖のポリリン酸を分解していること、それぞれの分解活性は長鎖ポリリン酸とピロリン酸によって阻害されていることを明らかにした。また、両酵素はポリリン酸分解活性に比べて低いものの、ATP、GTPやpppGppの分解活性も有していた。また、Ppx1とPpx2はN末端領域において相同性があり、Ppx2はさらにPpx1より200アミノ酸程度長いC末端領域を有している。Ppx2のC末端領域にKClが作用し、活性化するとともに、このC末端領域は長鎖のポリリン酸の結合に関与していることを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 前年度と今年度において、目標としていた６つのポリリン酸関連酵素の酵素学的諸性質の検討が終わり、これまでにそれらを５つの英語論文として発表することができ、また、日本生化学学会や日本分子生物学学会にて研究内容を発表することができた。さらに次年度の目標である粘液細菌における飢餓時におけるポリリン酸の合成機構の解明やポリリン酸の機能解析にも着手できたので、おおむね順調に進展していると評価した。
Strategy for Future Research Activity	最終年度は下記の2つを主な目的として実験を行う。１．粘液細菌におけるポリリン酸合成及び分解機構の解明　ポリリン酸を合成する際に初発となるポリリン酸の鎖長については、知る限り報告されていないので、種々の鎖長のポリリン酸を用いてリコンビナントのポリリン酸合成酵素(Ppk1）の合成活性を測定するとともに、合成されたポリリン酸をNativeゲル電気泳動にかけ、合成された鎖長や量を測定する。また、粘液細菌のPpk1の発現時期を酵素活性及びRT-PCR法を用いて特定する。さらに粘液細菌におけるポリリン酸分解酵素Ppx1とPpx2の酵素活性を測定し、それらが機能する時期を酵素活性とRT-PCR法により特定する。また、野生株とそれぞれの欠損変異株から、ポリリン酸を経時的に抽出し、ポリリン酸量と鎖長を測定する。これらの実験を通し、ポリリン酸は飢餓時のいつ頃からどのような鎖長のポリリン酸にATPのリン酸基を転移して作られ始めるのかを明らかにし、さらに飢餓時における経時的なポリリン酸の鎖長と蓄積量及びポリリン酸分解酵素による分解時期と分解量を明らかにする。 2．ポリリン酸の機能解析　飢餓時に作られるポリリン酸がどのような機能を持っているかを下記の３つの実験を中心に行う。(1)ポリリン酸を用いてATPが合成されているのか、されているのであればどの程度のATPがポリリン酸から合成されているのかをポリリン酸合成酵素あるいは分解酵素欠損株を用いて測定する。(2)ポリリン酸の合成によって種々のストレス適応が誘導されるかどうかをポリリン酸合成酵素あるいは分解欠損株を用いて調べる。(3)ポリリン酸は２価の金属塩とキレートすることが知られているが、粘液細菌における細胞内の遊離金属塩濃度の変化を測定し、Mg2+やMn2+、Ca2+の濃度変化により種々の酵素活性に影響を与えていないか調べる。
Causes of Carryover	2019年度（初年度）と2020年度（今年度）は備品購入のため、予算配分を多くしたため、2021年度（最終年度）は交付金額が40万円と少ないので、試薬等の購入に支障が生じないようにするため、2020年度は使い切らず、2021年度に使用できるようにした。