Differentiation of oxygen-tolerant nitrogen-fixing organ in the actinobacterium Frankia

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05772
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 九町 健一 鹿児島大学, 理工学域理学系, 准教授 (70404473)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 窒素固定 / 放線菌 / 酸素 / 分子遺伝学

Outline of Annual Research Achievements

窒素固定は大気中の窒素ガスからアンモニアを生成する反応であり、生態系への窒素養分の供給に不可欠な生体反応である。これまで発見された窒素固定生物は細菌に限られ、それらは多様な分類群に分布する。
窒素固定反応を触媒する酵素は酸素によって容易に失活するため、多くの窒素固定細菌は酸素の少ない環境でのみ窒素固定を行う。Frankia属の放線菌はベシクルと呼ばれる酸素耐性の器官を発達させ、その内部で窒素固定酵素を合成することで、酸素の存在下（つまり大気中）でも窒素固定を行える。私たちはこれまでベシクルの発達に異常を示すFrankiaの変異体を多数単離している。本課題では、それらの特徴を詳しく調べて発達のどの段階に異常を持つかを知り、異常の原因となる遺伝子を同定することを目指して研究を行っている。
昨年度までの研究で、いくつかの変異株においてはベシクル発達異常の原因と思われる変異遺伝子が予想された。今年度は、それぞれに対応する正常な遺伝子を変異株細胞に導入し、ベシクルの発達を観察することを試みた。これは相補実験と呼ばれる方法であり、もしベシクル発達が正常に回復していれば、遺伝子の予想が正しかったことが証明できる。遺伝子を細胞に導入する手法は形質転換と呼ばれ、フランキアでは長らく成功していなかったのだが、2019年にアメリカのグループが大腸菌との接合伝達を用いた方法を開発した。私たちの研究室で、この方法をいくつかの変異株および野生株のフランキアに対して行ったが、遺伝子導入の起こった細胞は単離できなかった。したがって、報告されている形質転換法は結果を再現するのが容易ではなく、実験条件の最適化が必要であることが分かった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

フランキアでは長年成功していなかった形質転換が、大腸菌の接合により行えるという論文が、2019年に発表された。今年度はその方法を用いて、窒素固定変異体N7C9株・N9D9株・N10E6株について、相補実験による原因変異の同定を試みた。これらの株については、変異株（および復帰変異株）のゲノム解析により原因変異の候補が予想できている。候補変異が位置する遺伝子を、野生株のゲノムを鋳型としたPCRによって増幅し、接合用のプラスミドベクターにクローニングした。それらの組換えプラスミドを、論文記載の方法に従って各変異株に導入を試みた。しかし、形質転換コロニーを得ることはできなかった。
野生株のフランキアに対して空ベクターを導入する実験 ― 論文では成功している ― も行ったが、やはり形質転換コロニーは得られなかった。以上の結果から、報告されている形質転換法は結果を再現するのが容易ではなく、当研究室での実験条件の最適化が必要であることが分かった。
ベシクル膜の発達に異常を示すN4H4変異株については、酸素感受性蛍光色素MARによる染色によりベシクル内の酸素濃度を評価した。N4H4株のベシクルは野生株のものに比べて蛍光強度が明らかに弱く、ベシクル内の酸素濃度が上昇していることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

形質転換については、接合に用いる細菌のグロースフェイズや接合を行う培地を検討するなどして最適化を試みる。また、エレクトロポレーションを用いた形質転換法も近年発表されたので、そちらも試してみる。
原因変異の同定については、形質転換による相補実験のみに頼るのではなく、変異株と復帰変異株の次世代シーケンサーによるゲノム解析にもとづく方法も並行して進める。具体的には、原因変異候補のサンガー法による確認（G23D3株）、復帰変異株の単離と原因変異候補のサンガー法による確認（N7C9・N9D9・N10E6株）、復帰変異株の単離とそのゲノム解析（N7C9・N9D9・N10E6株）、復帰変異株の単離（G15B2株他）に取り組む。
ベシクルは形成するが窒素固定が行えない変異株は、ベシクル膜の発達が異常な可能性が考えられる。それらの株については、暗視野顕微鏡による膜厚の評価と酸素感受性蛍光色素によるベシクル内酸素濃度の評価を行う。ベシクル膜発達異常の変異株は、低酸素濃度下では窒素固定を行うと予想されるので、その点を実験的に検証する。
アンモニア欠乏を感知してからベシクルが形成されるまで間に、分子レベルでどのようなイベントが起こるかについてはほとんど知られていない。恐らくベシクル分化に重要な遺伝子の発現誘導が起こると考えられるので、野生株でRNAseqを行いそのような遺伝子の同定を試みる。

Causes of Carryover

コロナウイルスのため、学会が遠隔開催となり、計画していた旅費の支出がなくなった。来年度は恐らく対面開催されると思われるので、その旅費として使用する。