Differentiation of oxygen-tolerant nitrogen-fixing organ in the actinobacterium Frankia

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K05772
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 九町 健一 鹿児島大学, 理工学域理学系, 准教授 (70404473)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 窒素固定 / 放線菌 / 酸素 / 分子遺伝学

Outline of Annual Research Achievements

窒素固定は大気中の窒素ガスからアンモニアを合成する反応であり、生態系への窒素養分の供給に重要な役割を担っている。窒素固定反応を行う酵素タンパク質は酸素によって損傷するので、多くの窒素固定細菌は低酸素環境で窒素固定を行う。Frankia属の放線菌は厚い外壁により酸素の流入を防ぐベシクルという構造体を発達させ、その内部で窒素固定酵素を発現するため、大気中でも窒素固定を行える。私たちはこれまでベシクルの発達が異常なFrankiaの変異体を多数単離している。本課題では、それらの特徴を詳しく調べ発達のどの段階に異常があるかを明らかにし、異常の原因となる遺伝子（変異原因遺伝子）を同定することを目指す。そのために、変異株の細胞集団の中からDNA複製エラー等の２次的変異により窒素固定能が回復した回復細胞を単離する。回復細胞と元々の変異株のゲノム解析を行い、それらが持つ変異を比較することにより、回復株で復帰変異やサプレッサー変異が起きている遺伝子を特定する。
G23G1変異株については、ゲノム解析により5つの復帰変異候補箇所が見かった。G21E10株およびG23C4株では、昨年度予測した復帰変異候補箇所を詳細に調べた結果、すべて原因変異ではなかった。これらの株ではトランスポゾンの挿入変異が起きている可能性が示唆された。
N9D9変異株については、昨年度予測したFrancci3_2702遺伝子は原因遺伝子ではなかったが、ゲノム解析により5つの復帰変異候補箇所が見つかった。
4種の変異株においてベシクル内酸素濃度が野生株より高いことを明らかにし、これらの変異株ではベシクル外壁が薄いことにより内部への酸素流入が起こり、窒素固定酵素が失活していると考えられた。
広宿主プラスミドとコドン最適化抗生物質耐性遺伝子を用いることにより、比較的安定なフランキアの形質転換細胞を作出することに成功した。