2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K05774
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
林 郁子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (80464527)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 細胞骨格 / 微小管 / トレッドミル / タンパク質 / 立体構造解析 / 動態解析 / 可視化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炭疽菌などの病原性バチルス族の毒素遺伝子はプラスミドにコードされる。この毒素プラスミドは細胞内で数個しか存在しないことから、プラスミド分配にはプラスミド上にコードされたチューブリン相同タンパク質TubZが分配モーターとして必須である。TubZはGTP依存的に重合して極性のある線維構造を形成する。TubZ線維は微小管同様プラス端で伸長しマイナス端で脱重合する性質をもつが、プラスミドは線維のマイナス端にDNA結合タンパク質TubRとともに局在しけん引されることが明らかになっている。しかし脱重合する線維の末端においてどのようにプラスミドが脱着を繰り返しながらけん引されるのか、その分子機構は不明である。
tubZ遺伝子はtubRとオペロンを形成し、TubRはtubRZオペロンの転写制御領域に結合する。tubRZオペロン近傍にコードされるDNA結合タンパク質TubYもプラスミド分配に補助的な役割を示すことが示唆されているが、どのように関わるのか不明なままであった。本課題ではTubZ線維、TubR：DNA複合体とTubYによるプラスミド分配の分子機構を明らかにすべく、結晶構造解析と高速AFMを用いて試験管内で解析を行った。さらにTubYの機能を解析するため、DNA結合実験を行うとともに、蛍光タンパク質と融合させて細胞内で発現させ、細胞内での局在を解析した。これによりTubYは自身のDNA認識配列に結合するだけでなく、TubR：DNA複合体にも相互作用すること、また細胞内では細胞膜に局在することを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
病原性バチルス族セレウス菌のTubYはDNA結合タンパク質であり、2つのドメインをもつ。N末領域はDNA結合ドメイン、C末領域は多量体を形成する。またC末端20残基は天然変性領域であり、膜結合性を示すことを明らかにしてきた。2020年度はプラスミド上におけるTubYのDNA結合領域を決定するとともに、TubYはTubR：DNA複合体にも相互作用することをフットプリント法により明らかにした。C末側の多量体化ドメインの結晶構造を2019年度に決定したが、この多量体化ドメインがないとTubYは膜に局在できないこと、C末端の天然変性領域は膜局在ばかりでなくDNAにも相互作用することを明らかにした。またこの天然編成領域が膜との相互作用によりヘリックスに構造変化することを明らかにした。2020年度は国際雑誌にこの結果を発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
私たちはTubR：DNA複合体が伸びた立体構造を形成することを2018年に発表しているが、このような伸びた構造体がTubZ線維の末端に選択的に相互作用する分子機構を明らかにする。
TubYのTubR：DNA複合体への相互作用を高速AFMで明らかにし、TubYの相互作用によりTubR：DNA複合体に構造変化が伴うのかを解析する。
またTubZの重合反応について、高速AFMを用いた計測を行う。現在、動的なTubZ線維を効果的に基板にのせるため人工的な脂質二重膜の条件検討を行っており、今後はDNAとTubZ線維の相互作用を解析する。
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