2020 Fiscal Year Research-status Report
酵素学の観点からのケモエンザイマティック反応によるアミノ酸やペプチド合成法の開発
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19K05775
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
松井 大亮 立命館大学, 生命科学部, 助教 (40748513)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平田 佳之 大阪薬科大学, 薬学部, 助教 (00745854)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ケト酸 / アミノ酸酸化酵素 / アミド結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 酵素反応によるケト酸合成：①アミノ酸酸化酵素活性を指標として、土壌から酸化酵素活性を探索した結果、酸化酵素活性を示す25株の微生物を得た。単菌化後、遺伝子解析によりほとんどが糸状菌であることが明らかとなった。②大腸菌異種発現系で、豚腎臓由来D-アミノ酸酸化酵素遺伝子を生産し、D-フェニルアラニンからケト酸生産の条件検討をした結果、最も収率の高い条件で97%であった。
2. ヒドロキシルアミンおよびアミノ酸の合成：①イミン還元酵素活性を指標として、土壌から還元酵素活性を探索した結果、20株以上の微生物を得た。高速液体クロマトグラフィーで立体選択性を調べ、R選択的な酵素活性を示す微生物5株、S選択的な酵素活性を示す微生物5株を選抜し、いずれもアルドキシムからヒドロキシルアミンへの変換能を有することを確認した。上記1同様に、遺伝子解析の結果、いずれも放線菌であることが明らかとなった。②フェニルピルビン酸、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸、3-（1H-インドール-3-イル）-2-オキソプロパン酸にヒドロキシルアミンを付加した後に、還元することで、最終的に73、52、65%の収率でヒドロキシルアミン体を得た。
3. ケト酸とヒドロキシルアミンおよびアミノ酸からアミド化合物の合成：①フェニルピルビン酸とN-ヒドロキシルフェニルアラニンとの反応条件を検討した結果、50度で24時間後に最も高い収率（82%）でN-ベンジル-2-フェニルアセトアミドを得た。②フェニルピルビン酸と各種ヒドロキシルアミンとの縮合反応について検討した結果、ベンジルヒドロキシルアミンが最も反応性が高いことを明らかにした。また各種ヒドロキシルアミノ酸との反応においてもN-ヒドロキシルフェニルアラニンとの反応性が高いことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 酵素反応によるケト酸合成：L-アミノ酸やD-アミノ酸、アミンなどに作用する様々な酸化酵素活性を示す微生物を取得し、単菌化に成功した。これらの酵素を用いれば、様々なアミノ酸からケト酸を合成することが可能である。さらに豚腎臓由来D-アミノ酸酸化酵素を用いたD-フェニルアラニンからフェニルピルビン酸の合成条件を確立しており、今後この条件を基準として様々なケト酸合成を検討することが可能である。
2. ヒドロキシルアミンおよびアミノ酸の合成：アミノ酸から酵素反応でN-ヒドロキシルアミノ酸を合成することは難しいことから、ケト酸からヒドロキシルアミンを反応させることによりアルドキシムを合成し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することでケト酸からヒドロキシルアミノ酸を合成する方法を確立した。
3. 様々なケト酸およびヒドロキシルアミンおよびアミノ酸との合成条件を検討した。これらを指標として、今後その他の合成を検討することができ、アミド化合物のライブラリー作成が可能である。
以上のことから、反応の基盤となる技術の確立が出来ており、次年度からは得られた酵素の精製および特性解明、アミド化合物のライブラリー作成とその利用を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 酵素反応によるケト酸合成：スクリーニングで取得した広い基質特異性を示す酵素活性を有する微生物の培養条件を検討し、各種クロマトグラフィーを用いて酵素を精製した後に、酵素科学的特性解明を行う。実際にケト酸合成を行い、有用な酵素に関してはN末端配列を明らかにした後に、遺伝子クローニングを実施する。さらに、得られた酵素の大腸菌を用いた発現系の構築を行う。
2. アルドキシム還元酵素も上記1と同様に酵素の特性解明を実施する。
3. 96穴プレートを用いたアミド化合物の合成系を確立し、アミド化合物のライブラリーを確立した上で、ヒストン脱アセチル化酵素Iの阻害活性などの迅速なスクリーニング系を確立する。
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