2020 Fiscal Year Research-status Report
非タンパク性アミノ酸を独創する微生物酵素研究とその応用利用
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19K05776
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
丸山 千登勢 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (20452120)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 非タンパク性アミノ酸 / 生合成 / 二次代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
非タンパク性アミノ酸（NPAA）は、生体内においてアミノ酸代謝中間体や神経伝達物質として機能するだけでなく、生物組織や天然有機化合物の構成成分として機能しており、産業上重要な化合物の一群である。本研究で我々は、NPAAの新たな探索資源および安価な供給資源として、微生物が生産するペプチド系二次代謝産物の多様性に着目した。
3つのNPAA（phenylalanine誘導体、hydroxy-L-valine、beta-homolysine）から構成されるペプチド化合物resormycinは、Streptomyces属放線菌が生産する植物病原真菌特異的な抗生物質である。構成成分の一つであるbeta-homolysineは、有機合成品が医薬品の合成原料やアミノ酸アナログとして市販されているが、天然物からは見つかっておらず、resormycinは数少ない天然由来beta-homolysine含有化合物である。これまでにbeta-homolysine生合成に関する研究報告はなく、beta-homolysineは新規経路によって生合成される可能性が示唆された。またL-valineのメチル化、水酸化誘導体は、数多くの天然有機化合物に含まれており、生理活性に重要な役割を担っているが、L-valineのメチル化および水酸化酵素が実際に同定された例は少ない。これら修飾酵素は、創薬研究においてペプチド系化合物の多様性創出に有用なだけでなく、臨床分野においてもアミノ酸濃度測定法への活用が期待されている。本研究で明らかにするresormycin生合成機構は、このような学術的、工業的に価値の高いNPAAおよびアミノ酸修飾酵素の探索と応用利用に有意義な知見を与えると期待している。そこで本年度の研究では、昨年度に同定したresormycin生合成遺伝子群について、遺伝子破壊実験および組換え酵素を用いたin vitro反応による機能解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年の研究で、resormycin生産菌であるStreptomyces platensis MJ953-SF5より2つの非リボソーム型ペプチド合成酵素（NRPS）遺伝子を含む遺伝子群（約50 kbp）を取得し、resormycinを生産しない異種放線菌を宿主とした異種発現実験により、resormycin生合成遺伝子群であることを同定した。さらに本遺伝子群が有する2つのNRPSの基質特異性解析の結果から、beta-homolysineが生合成中間体として生合成されることも明らかにした。
そこで本遺伝子群に含まれる各酵素遺伝子の機能推定を行い、beta-homolysineの生合成遺伝子を探索した結果、我々はL-arginineの代謝物であるagmatineをputrescineに変換するagmatinaseをコードするorf14を見出した。実際に、Orf14組換え酵素を用いたin vitro反応においても、Orf14がagmatineからputrescineを生成したことから、beta-homolysineの一部がL-arginineから生成されると考えられた。そこで13C-L-arginineを用いた添加培養実験を行い、生成物をHPLC/HR-TOF-MS2にて分析したところ、13C-L-arginine由来のputrescineが、resormycinのbeta-homolysine分子内に取り込まれた可能性が強く示唆された。このことから、beta-homolysineは、これまでに報告のない、新規経路にて生合成される可能性を導くことができた。
また本遺伝子群についてそれぞれ破壊実験を行ったところ、beta-homolysineの活性化に関わるNRPS遺伝子破壊株において、resormycinの生産性が完全に消失した一方で、beta-homolysineを生産蓄積することが判明した。そこで各遺伝子破壊株において、beta-homolysineの生産蓄積を指標に、beta-homolysine生合成に関わる遺伝子の探索を行った結果、aminotransferaseをコードするorf4遺伝子破壊株ではresormycinの生産性だけでなく、beta-homolysineの生産性も消失していることが判明した。このことから、Orf4は、beta-homolysineの生合成に関与していることが強く示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の結果から、beta-homolysineは、putrescineを出発物質として、Orf4といくつかの生合成酵素による増炭反応が触媒されて生合成されると予想した。そこで、orf4以外の増炭反応に関与する酵素遺伝子を同定するために、引き続き、resormycin生合成遺伝子群の破壊実験を進め、生合成中間体を同定する予定である。本遺伝子群に含まれる各遺伝子の機能推定の結果から、L-valineからL-Leucineへと変換する酵素に相同性を示すOrf11, 12, 13, 15の4つの遺伝子が、増炭反応に関与していると予想しており、これらの酵素遺伝子を中心に、遺伝子破壊実験、および組換え酵素を用いたin vitro反応による機能同定を進める。
また、resormycinが有するhydroxy-L-valine構造は、数多くのペプチド系天然物に含まれており、化合物の生合成に重要な役割を担っている。しかしながら、L-valineの水酸化酵素遺伝子が同定された例は少ない。またphenylalanineのクロル化や水酸化、脱水素化を触媒する酵素は、フェニルケトン尿症の新たな診断要酵素として利用できる。申請者らが同定したresormycin生合成遺伝子群には、これらのL-valineおよびphenylalanine修飾酵素遺伝子が含まれており、これら酵素遺伝子の同定、および詳細な機能解析は、学術的、工業的に価値の高い酵素と考えている。resormycin生合成遺伝子群の機能推定の結果から、すでに候補遺伝子（orf5、7、8、16）を見出しており、本年度の研究では、これらの組換え酵素を用いたin vitro反応を行い、詳細な機能解析を進める。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染拡大の影響で、計画していた国内学会での成果報告の中止や研究活動の自粛が相次いだため、旅費の支出および消耗品の購入を取りやめた。
またNPAAを含む新規生理活性物質の創出について、本年度中に学術論文への投稿を計画しており、そのための英文公正料や論文投稿料を充実させたいと考えている。
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Research Products
(3 results)
