Characterization of a novel bacteria responsible for the arsenite oxidation in the rhizosphere of arsenic hyper-accumulator, Pteris vittata

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05778
• Research Institution: Tohoku Gakuin University
• Principal Investigator: 宮内 啓介 東北学院大学, 工学部, 教授 (20324014)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 亜ヒ酸酸化細菌 / ファイトレメディエーション

Outline of Annual Research Achievements

ヒ素高蓄積植物であるモエジマシダは、環境中のヒ酸を根から吸収し、亜ヒ酸はヒ酸に酸化してから吸収する。亜ヒ酸酸化細菌Pandoraea sp. NE5株は、モエジマシダ根圏から単離された、亜ヒ酸酸化能を有する細菌である。しかし、そのゲノム配列からは、既知の亜ヒ酸酸化酵素遺伝子であるaioABに相同性をもつORFは見出されなかった。そこで、本菌の亜ヒ酸酸化酵素遺伝子を明らかにするとともに、モエジマシダ根圏での本菌の役割を探ることとした。NE5株にトランスポゾンを導入し、亜ヒ酸酸化能を失った株を単離し、トランスポゾン挿入部位を解析したところ、モリブデンの取り込みに関与する遺伝子であった。亜ヒ酸酸化酵素AioABもその活性にモリブデンを必要とすることから、NE5株の亜ヒ酸酸化酵素もAioABと似た配列をもつ可能性が示唆された。AioBと低いながらも相同性を示す酸化酵素遺伝子候補をゲノム配列から探索し、8個の候補遺伝子を得た(ORF番号03883、04514、00071、02600、03879、04546、01980、04421)。それぞれのORF、さらにそれらを含むオペロン構造をもつ遺伝子群をPCRで増幅し、高発現プロモーター下に挿入したプラスミドを作製し、大腸菌JM109及び野生株であるNE5株に導入したが、これまでのところ亜ヒ酸酸化能の大幅な上昇は見られておらず、他の因子の関与の可能性も考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

トランスポゾンを用いたランダムな変異株作成によって、亜ヒ酸酸化能を失った変異株を取得することができた。酸化酵素のクローニングはゲノム配列から予想されたORFを高発現させても活性の大幅な上昇が見られず、停滞している。これに関しては、高発現していることをRT-qPCRで確認することが必要である。また、クローニングがうまくいっていないORFがまだ存在するので、それらに関しては早急に実験を進めていきたい。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、亜ヒ酸酸化酵素遺伝子のクローニングを進めていく。活性にはモリブデンが必要である可能性が高いため、モリブデン結合部位をもつORFをゲノム配列から抽出することも考えている。また、モエジマシダの水耕栽培にNE5株を加えて、NE5株がモエジマシダの生育やヒ素吸収に与える影響を調べる予定である。

Causes of Carryover

必要な消耗品を購入する必要があったが、若干のストックがあったため、次年度に購入することとした。