部位特異的遺伝子増幅機能を応用した放線菌二次代謝産物生産能力増強システムの構築

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K05779
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 小松 護 北里大学, 感染制御科学府, 講師 (40414057)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 放線菌 / 二次代謝産物 / 遺伝子増幅 / 物質生産

Outline of Annual Research Achievements

放線菌Streptomyces avermitilisのゲノム縮小株(SUKA)における、S. kanamyceticusならびにStreptomyces sp. RM04株由来のZouAの部位特異的遺伝子増幅機能を応用した二次代謝産物生産能力増強システムを構築した。zouA_kanをRsB-attBs-RsA-zouA_kanの並びでカセット化し、線状プラスミドSAP1に導入した。chloramphenicol(Cml)生合成遺伝子を含むpCML2をSAP1上のattBサイトに導入した。pCML2の選択マーカーであるapramycin耐性遺伝子を利用し、培地中のapramycin濃度を段階的に低濃度から高濃度に添加量を増やし、高濃度のapramycinに対して耐性を示す株を液体培養によって集積した結果、Cmlクラスターが増幅して巨大化したと推測されるSAP1が観察された。増幅されたpCML2を含むSAP1の存在比は極めて低かったが、Cmlの生産量はzouA非導入株の2倍程度(0.4g/L)まで増加した。一方で、zouA_RM04の場合では、pCML2をSAP1ベクター上への導入のみで、効率良くcmlが増幅された。
更に効率の良い遺伝子増幅効果を期待して、Cumateを誘導基質とした誘導型プロモーター(Pcmt：P21-cmt-CymRシステム)を用いた結果、cumate添加の有無にかかわらず、効率の良いpCML2の増幅が確認された。RM04株由来の野生型プロモーターを利用した当初の結果と比較しても顕著な増幅効果が見られたことから、今後はPcmtを利用することによって、効率の良い遺伝子増幅が期待できる。また、パルスフィールド電気泳動の結果、増幅された遺伝子領域は欠失することなく安定的に保持されており、観察できる限り、11コピーまで増幅されていた。