2020 Fiscal Year Research-status Report
Explotiation of probiotic system capable of reducing peroxides
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19K05780
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
新村 洋一 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (00180563)
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2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 過酸化脂肪酸 / 過酸化水素 / 過酸化物還元乳酸菌 / 過酸化脂肪酸還元酵素 / 乳酸菌 / Lactobacillus plantarum / glutathione reductase / 酸化ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私達は過酸化脂肪酸を積極的に還元するLactobacillus plantarum P1-2株を分離し、酸素感受性短寿命変異体の線虫に本菌を投与したところ、平均寿命の延長と老人性しみ(リボフスチン)の生成が抑制された。続いて鉄剤で消化管の脂質過酸化を誘導したラットに本菌を投与したところ、大腸粘膜中の脂質過酸化指標の低値を示す結果を得た。ラットにおける生理活性は死菌体で消失することから、酵素に起因と推定された。そこで本菌の過酸化脂肪酸分解機構解明を目的として、I.過酸化物分解酵素精製と反応機構解析を試みた。
本菌の無細胞抽出液からカラムクロマトグラフィーにより50kDaと45kDa,48kDaの酵素が得られた。過酸化水素分解活性を持つ画分から精製された酵素はNADHを電子供与体として過酸化水素に対して活性を示し、酵素のアミノ酸配列からNADH peroxidaseと同定された。過酸化脂肪酸分解活性を持つ画分から精製された2種酵素はNAD(P)Hを電子供与体として過酸化脂肪酸還元活性を示し、アミノ酸配列はE. coliの glutathione reductaseと43%similarityを示した。glutathione reductaseが過酸化脂肪酸 を分解するという報告は見いだせない。反応機構解明のためX線結晶解析を試み、反応に関与するアミノ酸残基の同定中である。
生体内過酸化物の分解は、疾病防御のためのプロバイオティクス開発に有効である。盲腸が発達したラットより、ブタの腸内構造がヒトに類似している。そこで、II.ブタのin vivo 酸化ストレス活性評価系の確立を試みている。ブタ飼育用のL. plan. P2株大量培養系、飼料調製法が確立できたので、現在ブタ母子に本菌を投与し。その投与効果を、体重増減、過酸化指標変化、血液生化学的解析、糞便中の菌体分析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
理由: 2020年度目標として以下２目標を掲げていた。
１．L. plan. P2株の過酸化脂肪酸還元酵素反応機構解析: 昨年度、2種の過酸化脂肪酸還元酵素における過酸化脂肪酸基幹反応解析が修了したため、反応機構解明のためX線結晶解析を行う。解析結果により部位特異的変異酵素を作成し、反応解析に供したい。2．分離株(L. plan. P2株）を活用する酸化ストレス防御系の開発。: 昨年度、in vivo ラット系による酸化ストレス活性評価系を確立し,L. plan. P2株の過酸化脂肪酸防御活性の大腸での発現に成功した。母子における投与効果、血液生化学的解析、腸内のフローラ解析を引き続き行う。過酸化水素還元菌として、 P. pent. Be1株の還元活性が低いため、新たに、同活性を持つ食用菌株の検索を行う。過酸化水素分解活性を有す食用酵母の複数選抜に成功しているので、L. plan. P2株共培養系として評価する予定である。
2020年度実績：
1．L. plan. P2株の過酸化脂肪酸還元酵素反応機構解析：L. plan. P2株の過酸化脂肪酸還元酵素2種のX線結晶解析に成功し、反応関与と推定されるアミノ酸残基の部位特異的変異酵素を作成中である。
2．分離株(L. plan. P2株）を活用する酸化ストレス防御系の開発: ブタ母子飼育用L. plan. P2株大量培養系、飼料調製法が確立できた。現在ブタ母子に本菌を投与し、その投与効果として体重増減、過酸化指標変化、血液生化学的解析、糞便中の菌体分析を行っている。過酸化水素還元菌として 新たに食用酵母2株の選抜に成功した。そこで、L. plan. P2株共培養のための食用培地の開発を試みている。現在、子豚用の液体培地の調製に成功した。ヒト用プロバイオティクスでも使用可能な食品素材で母豚用の固体培地の調製を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度目標として2020年度の結果を基に、以下２目標を掲げる。
1．L. plan. P2株の過酸化脂肪酸還元酵素反応機構解析：L. plan. P2株の過酸化脂肪酸還元酵素2種のX線結晶解析に成功した。そのデータから反応関与と推定されるアミノ酸残基の部位特異的変異酵素にも2020年度に成功しているので、変異酵素を用いた反応機構解析から、過酸化脂肪酸還元酵素反応機構を明らかにしたい。
2．分離株(L. plan. P2株）を活用する酸化ストレス防御系の開発: ブタ母子飼育用L. plan. P2株大量培養系、飼料調製法が確立できた（2020年度）。次年度はブタ母子に本菌を投与し、体重増減、過酸化指標変化、血液生化学的解析、糞便中の菌体分析を継続し、その結果から、本菌の投与効果を評価したい。本実験系では、抗菌剤非投与下で飼育を行っている。薬剤耐性菌汚染が世界的に問題になっており、本菌投与の抗菌剤代替効果についても評価し、過酸化脂肪酸還元酵素反応機構を基盤とする分離乳酸菌株による酸化ストレス防御系を開発したい。
過酸化水素還元菌として 新たに食用酵母2株の選抜に成功した。この酵母は、37℃にける生育が良好で、プロバイオティクスとして期待できるため、L. plan. P2株共培養のための食用培地の開発を試みている。現在、子豚用の液体培地の調製に成功した。母豚への投与では、固体培地が必要になる。そこで、ヒト用プロバイオティクスでも使用可能な食品素材で母豚用の固体培地を確立し、畜産プロバイオティクス資材としても検討したい。
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| Causes of Carryover |
2020年度 国際フラビン、フラビンタンパクシンポジウム（オーストリア）が延期となり2021年度秋期大会が提案されている。秋期の国内外状況と、本研究課題の進行状況を考慮し、秋期シンポジウムへの参加を検討したい。
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[Journal Article] Free Flavin Participates in Iron and Also Oxygen Metabolism in Bacteria2020
Author(s)
Tomonori Suzuki, Shinya Kimata, Junichi Satoh, Kouji Takeda, Daichi Mochizuki, Ken Kitano, Akio Watanabe, Etsuo Yoshimura, Masataka Uchino, Shinji Kawasaki, Akira Abe, Youichi Niimura
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Journal Title
Journal of Bacteriology & Parasitology
Volume: 11
Pages: 1-7
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
