高効率多目的排出担体創製へ向けた変異型MscLの電気生理、分子動力学的特性解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05785
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 橋本 賢一 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70508382)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: メカノセンシティブチャネル / MscL / 分子動力学シミュレーション

Outline of Annual Research Achievements

一般的にメカノセンシティブチャネルは細胞が低浸透圧ストレスに晒された際に開口することで膨圧を下げる安全弁として機能していると考えられている。これまでの研究により、グルタミン酸生産菌として知られているCorynebacteriumglutamicumにおいて、このチャネルが非低浸透圧ストレス下であるにもかかわらず細胞内で合成されたグルタミン酸を細胞外へ排出する物質排出担体として機能していることを明らかにしてきた。本研究課題においてメカノセンシティブチャネルの一種であるMscLの変異体がイノシン酸の生合成を強化した大腸菌において生産性を向上することを明らかにした。MscLのG30E変異体とG46D変異体はともに野生型と比べて開口しやすくなっているが、イノシン酸の生産性はG46Dのみで顕著に向上した。
全原子分子動力学シミュレーションにより、G30E変異型G46D変異型ともに、開口性に影響すると考えられる細胞膜脂質分子との相互作用、水分子との相互作用は、野生型より安定であり、細胞外ループ領域のゆらぎが野生型よりも小さいこと、開口に伴うTM1ヘリックスの回転が野生型よりも大きいことが示唆された。これらが変異型MscLが野生型よりも開口しやすくなる原因であることが推測される。
またTM1ヘリックスに注目すると、G30E変異型は野生型と比べ大きく変化していないものの、G46D変異型は38番目のアラニン部分で大きくねじれていることが示唆された。この部分はTM1とTM2の相互作用に関与していると考えられることから、G46D変異型MscLがIMP生産性を向上させた理由の一つであることが予想された。
G46D変異体に生じたねじれを解消する目的でA38Vを追加した二重変異体を作成した。この二重変異体を導入したイノシン酸生産株ではG46D単変異体と比較してイノシン酸生産性が向上する結果を得た。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新しい実験環境における実験再現性の確立に予想より多くの時間を費やすこととなった。また、新型コロナウイルス感染症による行動制限のため、別の施設で行う必要のある電気生理学的解析関連の実験時間の確保が困難であり、計画の遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

イノシン酸過剰生産を目的に代謝改変された大腸菌にG46D変異型MscLを導入すると、イノシン酸生産量の向上と合わせて生育の回復が見られる。これは細胞内に過剰蓄積されたイノシン酸がG46D変異型MscLを介し細胞外へ排出されることにより、細胞内代謝が生育に適した方向へと変化したことが予想される。MscLのランダム変異体ライブラリを作成し、イノシン酸生産株へ導入することで生育の改善がみられる株をスクリーニングする。
既に得られた変異型MscLと合わせて分子動力学的解析、電気生理学的解析により、その特性、機構を明らかにすることで物質生産性に優れた新規物質排出担体の創出を行う。

Causes of Carryover

前年に引き続き、研究環境変化に伴う計画の遅れから電気生理学的解析に必要な消耗品購入費等が大幅に少なくなった。次年度はこの分の費用をMscLの新規変異体の取得のための試薬類の購入、人工遺伝子合成、DNAシーケンスなどに充当することを予定している。