2020 Fiscal Year Research-status Report
細菌sRNAにおける標的RNAの切り替えと安定性制御に関する研究
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19K05787
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
鈴木 一史 新潟大学, 自然科学系, 教授 (00444183)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現 / small RNA / Csrシステム / RNA結合タンパク質 / 応用微生物学 / キチナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、細菌sRNAによる遺伝子発現調節機構におけるsRNAの標的RNAの切り替えとsRNAの分解制御機構を明らかにすることである。Serratia marcescensのキチン分解利用系の遺伝子発現を連動的に制御するアンチセンス型sRNA ChiXには２つの標的mRNAがあり、一方から他方のmRNAに標的が変わる。その機構にはChiXターミネーターの5′側とターゲットmRNAとの塩基対形成が重要であることが明らかになった。さらに、S. marcescensと同様にChiXが制御するS. plymuthicaで構築したRNAシャペロンHfqの欠損株およびchiX欠損株の解析により、ChiX非依存かつ翻訳レベルでのHfqによる新たなchiR発現制御機構の可能性が示された。大腸菌においてRNA結合タンパク質に結合するsRNA CsrBの安定性は、膜結合タンパク質CsrDの関与によって環境に応答して調節される。他の細菌におけるCsr sRNAの安定性制御を確認するため、Aeromonas salmonicida のCsrシステムを解析した。この菌株のCsrDはアミノ酸配列の相同性から大腸菌とは異なる可能性があったが、大腸菌へのクローン化によって大腸菌CsrDと同様の表現型を示し、Csr sRNAの安定性制御に関与しているものと考えられた。A. salmonicidaのCsr sRNAは、大腸菌と同様に多数のステムループ構造とループおよび一本鎖部分のCsrA結合配列が存在する特徴を有していた。また、Csrシステム制御によるβ-1,6-GlcNAcポリマーの生産系の構築のため、大腸菌に種々の変異を加えた。その結果、β-1,6-GlcNAcポリマー合成酵素は発現するがバイオフィルム形成が低下した株を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コロナ禍のために実験を実施できない期間があったが、アンチセンス型sRNAおよびタンパク質結合型sRNAの両方とも新たな研究段階に入ることができた。アンチセンス型sRNAについては、遺伝子欠損株の取得がS. marcescensより得やすいS. plymuthicaを対象とする研究に移行した結果、hfq欠損株の解析に加え、hfqとchiXの二重欠損株の取得に成功し、解析を進めることができた。これにより、HfqがChiXの機能とは関係なくキチン分解酵素系の発現に影響を与えるという新たな制御機構の可能性が示された。S. plymuthicaはS. marcescensと同様のキチン分解酵素系の遺伝子群を有していることを確認できたので、この菌株を用いた研究の進展に期待できる。タンパク質結合型sRNAが関与するCsrシステムについての研究では、懸案となっていた大腸菌以外の細菌でのCsr sRNAの安定性制御の解析を進めることができた。A. salmonicoidaのCsrDは大腸菌CsrDとのアミノ酸配列の相同性が低かったが、大腸菌で機能することが確認された。さらなる解析により、細菌におけるCsr sRNAの安定性制御の重要性について理解が進むと考えられる。また、Csrシステムの制御を利用したβ-1,6-GlcNAcポリマーの生産において、大腸菌への新たな変異導入により、β-1,6-GlcNAcポリマー合成酵素の高発現にもかかわらずバイオフィルムの形成が少ない株を得ることができ、培養後の菌体回収とβ-1,6-GlcNAcポリマー精製の効率化に有効であると考えられた。このように研究は新たな展開を迎えており、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
[アンチセンス型sRNA, ChiXについて] HfqによるchiR発現制御機構の解析：S. plymuthicaのhfq欠損株はchiRが転写されるにも関わらずキチン分解酵素の発現が認めらない。HfqによるchiRの翻訳レベルでの制御について、chiR mRNAの5′ UTRへの変異導入等により解析する。検出不可能なRNAによる発現制御の証明：chiPの配列に置き換えたchiR mRNA 5′ UTRはRT-PCRで検出できないにも関わらずChiXによるchiRの発現抑制を解除した。S. plymuthicaや大腸菌を用いてRNAの安定性等の解析を行う。
[タンパク質結合型sRNA, CsrB/Cについて] CsrB/Cのターミネーター構造と安定性制御の解析：ターミネーターおよびその直前の一本鎖領域の配列が異なるCsrC sRNAの分解制御がCsrBと同様であるか、CsrCとCsrBのターミネーターの入れ替えや塩基置換の導入などを実施して詳細を調べる。安定性制御に関与するCsrDのアミノ酸残基の探索：CsrDの活性に重要なアミノ酸残基が、CsrCの分解についても同様に重要であるか明らかにする。A. salmonicidaにおけるCsr sRNAの安定性制御：A. salmonicida でcsrD等のcsr遺伝子欠損株を構築し、Csrシステムの機能とsRNAの安定性制御を調べる。sRNAの安定性制御の応用：CsrシステムのsRNA CsrBの発現と安定性の制御系を利用し、β-1,6-GlcNAcポリマーの大腸菌での生産について引き続き検討する。
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